体育运动对冠心病患者内皮祖细胞血管内皮损伤修复能力的改善作用研究

胡厚如 董兵 何江 余冰波 张小宇 夏文豪

心血管病死亡占我国居民疾病死亡构成40%以上，是我国居民健康的头号杀手。随着我国人口老龄化进程加速，心血管病患病率及死亡率呈井喷式增长，防治心脑血管病刻不容缓。冠状动脉粥样硬化性心脏病是危害老龄人口健康的致死致残重大慢病之一[1]。

引起冠状动脉粥样硬化的危险因素有高血脂、高血压、高糖尿、年龄、遗传因素及社会心理因素等，这些危险因素如何引起动脉粥样硬化的发生发展，目前存在多种有争议的学说。但各种主要危险因素最终都损伤动脉内膜，这一既定事实已得到普遍共识。因此，血管内皮损伤是动脉粥样硬化触发以及发展的重要环节[2]，同时也是维护血管内皮结构功能的完整性，防范内皮修复和内皮损伤之间失衡的关键治疗环节，促进动脉内皮损伤修复，从始发环节上抑制疾病发生发展对于心血管疾病预防和治疗有着重要意义。

作为来源于骨髓的可分化为内皮细胞的前体干细胞，内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一种重要的机体自身存在的血管内皮损伤修复机制，在血管内皮细胞损伤修复中扮演重要角色[3-5]。在内皮细胞受损的情况下，循环EPCs可增殖分化为内皮细胞，维持内皮系统结构和功能的完整。然而，众多研究显示，冠心病、增龄、高血脂等多种心血管疾病危险因素会导致机体外周血中EPCs数量下降和活性受损[6-8]。因此，促进冠心病患者循环EPCs数量的增加，血管损伤修复功能的恢复，维持内皮生理修复和病理损伤之间的平衡，对于心血管疾病的发生率死亡率的降低和预后的改善具有非凡意义。

随着对心血管疾病研究的不断深入，冠心病的治疗不仅仅局限于药物和手术。以运动为核心的心脏康复已成早期逆转内皮损伤防治心血管疾病防治的一个新方向，有望成为药物治疗和饮食控制之外的第三大干预措施[9-10]。研究表明运动可通过多种机制发挥重要的干预作用，如通过降低血清TC、LDL水平；促使血管内皮细胞产生NO等舒血管物质；激活体内的抗氧化防御系统抵消了氧化应激反应的影响等方式[11-12]。然而运动是否也可通过促进冠心病患者循环EPCs数量的增加，促进维持内皮生理修复和病理损伤之间的平衡，提高血管内皮化功能改善动脉弹性仍有待进一步研究。因此，本课题拟从临床角度出发，针对老年冠心病患者，研究合理的体育运动对患者循环EPCs促进内皮损伤修复能力的影响以及其潜在可能初步机制。

资料与方法

一、临床资料

选择2015年11月至2017年8月于广州中山大学第一附属医院住院且均经冠状动脉造影确诊冠心病且处于稳定期患者68例，随机分为对照组：32例，平均年龄（67.5±5.8）岁和实验组：36例，平均年龄（68.3±7.1）岁。冠心病诊断标准：指冠状动脉造影至少有一支冠状动脉血管可观察到直径狭窄≥50%。排除标准：近3个月有外科手术、创伤、急性感染史；血压偏低（＜ 105/65 mmHg，1 mmHg = 0.133 kPa）或药物控制不佳高血压者（＞ 160/90 mmHg）；无规律运动习惯及其他任何有踏车运动禁忌症患者；该研究方案经中山大学第一附属医院伦理委员会审核通过，研究对象入组前已签署知情同意书。

二、方法

1.运动试验：对照组给予常规治疗包括口服阿司匹林100 mg，1 次/d；口服瑞舒伐他汀钙片10 mg，1次/d，晚间服用；口服美托洛尔缓释片47.5 mg，1次/d，对照组不作运动干预，用以排除药物和时间对运动前后EPCs功能改变的影响；实验组给予相同剂量的常规药物，同时接受踏车运动，运动强度依据美国心脏协会所定制的训练和测试标准执行（受试者进行踏车运动30 min/d，每周3次，运动代谢当量为4.5，为期3个月）[15]。

2.EPCs的分离、培养和鉴定：在运动前后分别收集受试者外周静脉血20 ml，肝素抗凝，离心法分离出单个核细胞后加入EBM2培养基（含20%FBS），置培养箱孵育，4 d后弃未贴壁细胞，给予完全培养基继续培养至第7天。培养的EPCs鉴定采用双荧光染色法（DiI-ac-LDL/FITC-lectin）和流式免疫细胞法（检测EPCs特有的抗原标记物CD34+/ CD133+/KDR+）[13]。

3.EPCs的体外迁移实验：取第5代对数期细胞消化后，用含10 g/L牛血清白蛋白的培养基重悬细胞，将含有VEGF的培养液注入改良的Boyden小室的下室，将含有等量约2×105个悬液注入上室，培养24 h，用消毒棉签刮去滤膜上面的未移动细胞，固定10 min后荧光显微镜下观察，随机选择3 个视野取平均值[14]。

4.EPCs的体外黏附实验：将培养的人脐静脉内皮细胞消化重悬接种到六孔板中，待在培养箱中形成内皮细胞单层后，加入含适宜浓度的CM-DiI染料的EGM-2培养液继续培养；和EPCs孵育10 min后于细胞培养箱中培养3 h后，弃去培养基，PBS轻轻洗涤，用4%多聚甲醛溶液固定细胞10 min，DAPI液染色10 min后显微镜下观察，随机取5个视野计算黏附细胞数量[13]。

5.裸鼠颈动脉内膜损伤模型的构建：（1）手术：取10周龄的裸鼠，5%Chloral hydrate腹腔注射麻醉，剂量0.7 ml/100 g，同时用肝素钠皮下注射充分抗凝，游离右侧颈动脉鞘钝性撕开股动脉鞘，分别结扎颈外动脉远心端，血管夹夹住颈总动脉近心端和颈内动脉起始端。并且在其间剪开一小口，合适尺寸的导管导线从颈外动脉残端插入到颈总动脉内，旋转来回推送3次后退出并逐层缝合颈部切口。（2）EPCs的移植：将上述分离培养的EPCs消化重悬为5×105/100 μl细胞悬液，颈部内皮损伤手术后约3 h后裸鼠苏醒，通过裸鼠尾静脉注入。（3）伊文思蓝染色：将细胞移植3 d后裸鼠以上述同样的方法麻醉，经尾静脉注入100 μl的5%伊文思蓝溶液进行血管染色[13-14]。然后暴露颈部正中切口分离右颈总动脉，显微镜下观察伊文斯蓝染色情况并拍照。

6.血流介导的血管舒张功能（ flow-mediated dilation，FMD）检测：研究对象测试前禁食4 h，测试前10 h内无吸烟饮酒。然后在一个安静、温度舒适（25 ～ 26℃）房间内卧姿休息10 min后行FMD功能检测。采用日本UNEXEF超声血管内皮分析仪分析：袖带缚下1/3处，连接心电图，于右侧肘窝横纹上方2 ～ 10 cm处探测动脉，取其纵切面，调节探查深度和增益至清晰显示前后壁血管内中膜。然后反应性充血试验：将袖带气压缓慢增加至超过收缩血压50 mmHg，5 min后引起反应性充血，持续记录二维灰度图像和纵向波型。用提供的专业方法来估算FMD[13]。以上操作均由我科的专业技师完成。

7.脉搏波传导速度（pulse wave velocity，PWV）检测：使用日本PWV专业检测仪VP-1000。测定肱-踝动脉 PWV 作为评估大动脉弹性的指标，取左右两侧 baPWV 的高值进行统计分析。以上操作均由同一位经过培训的医师完成。

三、统计学分析方法

采用SPSS 17.0软件进行分析。年龄体重基线资料等计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，运动前后比较采用配对t检验。相关性分析采用Pearson法。以P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、受试者基线资料比较

共纳入68例我院冠状动脉造影确诊冠心病患者，按随机序列分配，分为对照组和实验组。两组运动前后基线资料比较差异无统计学意义（P＞ 0.05，表1）。

二、 FMD检测

与运动前相比，踏车运动3个月后实验组冠心病受试者的FMD升高（运动前：5.9%±2.1%；运动后：8.1%±2.6%；P＜ 0.01），提示血管内皮功能较运动前有所恢复。对照组无明显改变。（图1和表2）

表1 冠心病受试者基线资料（±s）

表1 冠心病受试者基线资料（±s）

注：对照组并无运动干预，此处运动前后只表示时间节点前后基线资料的测量情况

分组 例数 运动 年龄（岁）体质量（kg）体质量指数（kg/m2）收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）心率（次/min）对照组 32 运动前 67.5±5.8 71.8±7.2 24.7±2.5 126.4±6.8 62.8±6.4 70.7±5.5运动后 67.5±5.8 70.9±6.7 23.8±2.8 125.8±6.1 64.9±6.1 71.5±5.2实验组 36 运动前 68.3±7.1 69.5±6.9 24.3±2.2 124.4±6.7 62.4±5.8 68.7±6.5运动后 68.3±7.1 70.2±7.3 23.6±2.5 125.3±5.8 63.2±5.3 68.4±6.1

表2 健康受试者和冠心病受试者运动前后内皮功能和EPC功能检测（±s）

表2 健康受试者和冠心病受试者运动前后内皮功能和EPC功能检测（±s）

注：t值和P值均为实验组运动前后比较结果，对照组不作运动干预，前后均无明显差异

分组 例数 运动 FMD（%）PWV（cm/s）EPCs迁移（细胞/高倍视野）EPCs黏附能力（细胞/高倍视野）EPCs体内再内皮化（%）对照组 32 运动前 6.1±1.9 1625±156.4 34.8±5.1 32.8±4.2 37.4±5.5运动后 6.0±2.0 1596±119.8 31.2±6.7 28.4±6.3 38.9±5.2实验组 36 运动前 5.9±2.1 1618±160.2 30.6±5.4 30.5±4.8 55.2±9.1运动后 8.1±2.6 1456±125.0 52.5±8.9 48.2±7.6 36.1±4.9 t 值 3.253 2.781 3.767 4.311 5.315 P值 0.001 0.014 0.013 0.001 0.012

图1 荧光显微镜观察EPCs体外迁移实验（DAPI染细胞核，×40）

三、PWV检测

与运动前相比，踏车运动3个月后实验组冠心病受试者的PWV明显减低[运动前：（1618±160.2）cm/s；运动后：（1456±125）cm/s；P＜ 0.01]，对照组无明显改变（表2）。

四、EPCs体外迁移实验

与运动前比较，实验组患者运动后EPCs体外的迁移能力提高，对照组EPCs迁移能力改变差异无统计学意义（图1，表2）。

图2 荧光显微镜观察EPCs体外黏附实验（DAPI染细胞核，×40）

五、EPCs体外黏附实验

内皮细胞黏附实验结果发现：实验组冠心病受试者运动后荧光显微镜计数黏附在内皮细胞单层的EPCs数量较自身运动前明显增多（P＜ 0.01），对照组改变差异无统计学意义（图2，表2）。

六、EPCs体内再内皮化实验

研究结果显示：与运动前比较，注射实验组运动3个月后人EPCs的小鼠损伤血管再内皮化面积增大（运动后：55.2%±9.1%；运动前：36.1% ±4.9%；P＜ 0.01），对照组无明显改变（图3，4，表2）。

七、FMD与EPCs修复损伤内皮能力的相关性

将实验组运动前后FMD差值（运动后-运动前）与EPCs尾静脉注射裸鼠颈总动脉再内皮化面积差值按SPSS软件行Pearson相关分析。研究结果显示，运动前后FMD差值与EPCs移植前后再内皮化面积差值呈正相关（P＜ 0.01）。对照组差异无统计学意义（图5）。

八、PWV与EPCs修复损伤内皮能力的相关性

图3 对照组与实验组运动前后EPCs再内皮化面积比较

将实验组3个月的运动前后PWV差值与运动前后冠心病受试者EPCs尾静脉注射移植裸鼠颈总动脉再内皮化面积差值进行Pearson相关分析。研究结果显示，运动前后PWV差值与EPCs移植前后再内皮化面积差值呈正相关（P＜ 0.01）。对照组差异无统计学意义（图6）。

图4 裸鼠颈总动脉内皮伊文思蓝染色结果

图5 运动前后FMD差值与EPCs移植注射后再内皮化面积差值的相关性（n = 36）

图6 运动前后PWV差值与EPCs移植注射后再内皮化面积差值的相关性（n = 36）

讨 论

冠心病是目前我国城乡居民疾病死亡率最高的心血管疾病。运动康复作为独立于药物治疗和介入治疗之外的健康有效的治疗方式，在早期预防冠心病和防治病情恶化上扮演着重要角色[9-10]。本团队前期研究也显示，急性运动有提高青年健康受试者外周血中EPCs的数量和体外的迁移能力，平板运动可改善老年人EPCs的内皮损伤修复能力[13-14]。然而，体育运动是否能提高冠心病患者外周血中EPCs的功能活性，改善其内皮功能和血管弹性尚未见任何报道。

本研究入选我院冠状动脉造影确诊的冠心病受试者进行为期3个月的踏车运动，探讨运动对冠心病患者FMD、PWV及外周血中EPCs促进裸鼠颈动脉拉脱模型内皮损伤修复能力的影响。结果显示：相对于运动前和对照组相比，运动后的患者体内EPCs体外迁移及黏附功能有显著性提高。通过颈动脉内膜损伤模型，观察其归巢的EPCs体内损伤修复能力，结果显示：与体外的迁移黏附功能提高一致，运动后冠心病受试者EPCs颈动脉内皮损伤修复面积明显大于运动干预前。并且本研究利用运动前后FMD和PWV改善的差值与EPCs在体再内皮化面积的增加进行了相关性分析，结果显示改善的内皮功能和动脉弹性分别与提高的EPCs在体再内皮化能力之间存在正相关关系，提示体育运动改善冠心病患者内皮功能和动脉弹性的机制可能是与体内增强的EPCs的功能有关。

总之，本次试验主要探讨了体育运动对于冠心病患者EPCs体外迁移黏附功能以及内皮损伤修复能力的影响，同时分析了EPCs在体修复功能与内皮功能FMD、动脉弹性PWV之间的关系。研究分析显示，踏车运动可提高冠心病患者外周血EPCs内皮损伤修复能力，提高血管内皮功能和改善动脉硬度，且二者存在一定相关性。本研究结果为体育运动作为一种重要的生活方式防治冠心病等动脉粥样硬化性心血管疾病提供新的理论基础。然而本研究存在一些局限：冠心病患者样本量不够多；未对运动提高冠心病患者外周血EPCs内皮损伤修复能力的分子学信号通路机制进行深入研究；针对这些问题，本团队之后的实验将继续招募患者，提高样本量；同时，从分子生物学信号传导角度，深入探讨运动提高EPCs功能改善受试者内皮修复功能的相关机制，为临床研究提供更充分的证据。