盐度对岩扇贝Na+/K+-ATP酶活性的影响

王尧 曹善茂

摘 要：岩扇贝为国内引进的新品种，为了弥补国内在盐度对岩扇贝影响这方面研究的空白，利用从加拿大引进的岩扇贝Crassadoma gigantea幼贝，经过在不同盐度梯度（高盐36，正常30，低盐24）及不同盐度变化速率驯化后，取样，选取幼贝内脏团，采用试剂盒检测方式，检测不同盐度梯度下岩扇贝Na+/ K+-ATP 酶活性的表达。结果表明：在盐度30下，Na+/K+-ATP酶活性维持在较高水平，而在高盐36胁迫下，酶活力较盐度30的低，且在盐度骤变情况下尤为显著;在低盐24胁迫下，酶活性同样较盐度30下的酶活力低，且相对高盐胁迫活性更低

关键词：岩扇贝;盐度;Na+/ K+-ATP酶

岩扇贝Crassadoma gigantea隶属于软体动物门Mollusca、瓣鳃纲Lamellibranchia、珍珠贝目Pterioida、扇贝科Pectinidae。[1]广泛分布于北美太平洋沿海，自阿拉斯加到加利福尼亚半岛和墨西哥湾海岸等沿海地区，从潮间带到深至100米的海底均有分布。岩扇贝个体较大，肉质鲜美，养殖周期短，生长较快，适应的温度范围广，经济价值高，适合我国北方引种养殖。[7]

国外已有对岩扇贝的风味口感[2]、各种脂肪酸含量等营养成分[2]、产品冷藏肉质稳定性[3]的报道，并为育苗做了关于岩扇贝繁殖周期与排精产卵机制[4]、育苗的饵料种类及配比[5]、幼苗的附着生理[6]等方面的研究，但国内对岩扇贝的研究较少，仅有室内人工育苗技术[7]、海上中间育成[7]、幼贝摄食规律与环境适应能力[8]、闭壳肌高蛋白低脂肪的营养特点[9]等基础研究。

而盐度是贝类养殖过程中的重要水环境因子，对贝类机体呼吸、生长、抗氧化水平及免疫功能具显著影响[10]，海水盐度易受降雨、气候、河流径流等影响而发生变化甚至骤变，导致海水贝类抗氧化酶及免疫相关酶活性升降变化，贝类常因此而大量死亡，使养殖产业遭受经济损失。[11]Na+/ K+-ATP 酶存在于细胞膜，起着物质运输、能量转换及信息传递等重要作用，机体在遭受环境胁迫或疾病状况下，此酶活性发生改变。[12-14]因此，研究盐度变化与贝类的Na+/ K+-ATP酶活性变化关系对养殖生产具有重要意义。目前已发现盐度变化对日本沼虾[12]、大菱鲆[13]、红耳龟[14]、仿刺参[15]等水产动物的Na+/ K+-ATP酶活性产生显著差异。

目前国内外在盐度对岩扇贝生理指标影响方面已做了研究，而未有盐度对岩扇贝生化指标影响的报道。国内一些研究表明岩扇贝盐度适应范围大约在24～36。[16]实验通过研究盐度对岩扇贝Na+/ K+-ATP 酶活性的影响，以完善岩扇贝的生化指标理论，为今后的人工育苗、养殖生产等实践提供依据与指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试验地点

大连海洋大学海养楼重点实验室

1.1.2 扇贝来源

试验用的岩扇贝为引自加拿大的岩扇贝幼贝，选取活力良好、发育正常、规格相近、壳长为2-3 cm的幼贝90枚。

1.1.3 水质监测

暂养期间幼贝养殖水体盐度为30;在实验期间，三个实验组的幼贝养殖水体盐度分别维持在三个梯度：高盐36、正常盐度30、低盐24。

1.2 实验方法

1.2.1 幼贝暂养驯化

将12月份从加拿大引进的岩扇贝幼贝在大连海洋大学海养楼重点实验室控温循环水族箱中暂养7d，暂养期间盐度为30，水温14±0.3℃，持续充气，每天投喂小新月菱形藻（Rhomboid alga）25×104 cells/mL，视水色及幼贝摄食情况增减投饵量，每天全量换水。并观察幼贝的健康状况以期各条件状况趋于稳定。

1.2.2 盐度骤变实验

将暂养后各方面条件趋于稳定的幼贝分别放在高盐36、正常盐度30、低盐24中驯化天，盐度设三个梯度，高盐36、正常盐度30、低盐24分别为每个梯度三个平行，每个平行处理10个扇贝。低盐组的海水从正常海水盐度开始每天降3，依次为30、27、24;正常海水对照组的海水维持正常海水盐度30，其中上下波动应不超过1;高盐组的海水从正常海水盐度开始每天升3，依次为30、33、36。在达到既定盐度值24、30、36后设时间点0，4，8，12，24，36，48小时，每个时间点分别从各个实验组中取样一次。

1.2.3 盐度渐变实验

低盐组的海水从正常海水盐度开始每天降1，从30降低到24;正常海水對照组的海水维持正常海水盐度30，其中上下波动应不超过1;高盐组的海水从正常海水盐度开始每天升1，从30提升到36。在达到既定盐度值36、30、24后，每3天分别从不同实验组取样一次。

1.2.4 酶活性测定

从不同实验组中抽取的样品，选取内脏团，根据计算要求设置空白对照管，标准对照管，测定管，分别测 Na+/ K+-ATP 酶活性，Na+/ K+-ATP酶活性的测定均采用南京建成生物工程研究所试剂盒。

Na+/ K+-ATP 酶活力测定原理为ATP酶可分解ATP生成ADP和无机磷，测出无机磷的含量后利用公式可判断出ATP酶活力的高低。其活性单位定义为每小时1mg组织蛋白中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP活力单位，即微摩尔磷/毫克蛋白/小时（μmolPi/mgprot/hour）。

最后要测样本蛋白浓度用以上一公式的计算。蛋白定量原理为蛋白质分子具有-NH4+ 基团，棕红色的考马斯亮蓝显色剂加入蛋白标准液或样品液时考马斯亮蓝显色剂上的阴离子与蛋白的-NH4+结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度计算蛋白含量。

1.2.5 数据处理

用Excel輸入数据、生成图表后进行分析。

2 结果与分析

2.1 盐度急性实验

盐度骤变Na+/ K+-ATP 酶活力：随着盐度的骤变和驯化时间的不断延长，各组样本内脏团Na+/ K+-ATP酶活力变化见表1、表3，盐度30的对照组样本内脏团Na+/ K+-ATP酶活力变化见表2。

将各个盐度梯度的8个样本的Na+/ K+-ATP 酶活性数据作平均值，得到盐度30-36、30-24骤变和盐度30随时间延长的变化趋势（见图1）。由图1可见，盐度36组在4h-12h内Na+/ K+-ATP 酶活力持续较低，24h-48h活力呈先上升后下降的变化趋势。盐度24组在48h内出现两次先上升后下降的趋势，在12h、36h出现两个峰值。盐度30的对照组酶活力呈上升趋势。48h内盐度36组与24组总体均较对照组活性较低，而24组总体较36组活性低。

2.2 盐度渐变实验

盐度渐变Na+/ K+-ATP酶活力：随着盐度的渐变和驯化时间的不断延长，各组样本内脏团Na+/ K+-ATP酶活力变化见表4、表6，盐度30的对照组样本内脏团Na+/ K+-ATP酶活力变化见表5。

将各个盐度梯度的8个样本数据作平均值，得到盐度30-36、30-24渐变和盐度30随时间延长的变化趋势（见图2）。由图2可见，盐度36组在第3d-第9d有小幅度的先降后升的趋势，第9d后Na+/ K+-ATP 酶活力呈缓慢下降趋势。盐度24组酶活在第12d出现略微上升。盐度30的对照组在18d酶活力呈略微波动变化。18d内盐度36组与24组比对照组活性显著较低，而24组比36组整体活性较低。

3 结论

Na+/ K+-ATP酶参与Na+、K+跨膜主动运输，当水体盐度发生变化时，生物体内的离子平衡容易受盐度变化影响，生物体内的Na+/K+-ATP酶活性出现相应变化来对抗这种不平衡，用以维持离子稳态及渗透压平衡，Na+/ K+-ATP酶除能稳定渗透压平衡外，还为鳃、肾脏离子调控提供驱动力。而高盐或低盐可破坏生物膜结构，膜上Na+/K+-ATP酶活性也随之降低。有研究报道，仿刺参在盐度20-35范围内时，盐度越高，Na+/K+-ATP酶活性则越高，当盐度高于35或低于20时，其Na+/K+-ATP酶活性降低。钱佳慧等研究表明，华贵栉孔扇贝幼贝受盐度影响Na+/K+-ATP酶活性变化显著，且随盐度升高而呈先升后降的趋势，并发现在30.67时活力最高。这种受盐度胁迫Na+/K+-ATP酶活性随盐度变化而逐步升高或下降，达到最高和最低时逐渐适应的现象在褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼鱼、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、拟穴青蟹（Scylla Paramamosain）、军曹鱼（Rachycentron canadum）水生动物中均存在。这表明了Na+/K+-ATP酶在水生生物调节细胞渗透压时起重要作用，且在最适盐度下，活力最大。本实验发现，在盐度30下，Na+/K+-ATP酶活性维持在较高水平，而36高盐胁迫下，酶活力较适盐范围下的酶活力低，且在盐度骤变情况下尤为显著，与研究结论符合;24低盐胁迫下岩扇贝幼贝的Na+/K+-ATP酶活性同样较适盐范围下的酶活力低，其活性相对高盐胁迫活性更低。

本实验结果表明，盐度对岩扇贝适应生存环境具有显著影响，且与低盐胁迫相比下，岩扇贝对高盐胁迫的适应性相对较强。因此在岩扇贝引种驯化或人工养殖时应充分考虑盐度变化的影响，可以考虑培育耐高盐品种。

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