响应面法优化甜米酒酸菜发酵工艺

康 娇，薛桥丽，李 静，杨从绪，程镇朝，王 富，胡永金*

（1.云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 学报编辑部，云南 昆明 650201）

酸菜是我国传统发酵食品，但传统自然发酵的酸菜产品存在不稳定、发酵时间长、亚硝酸盐含量高等诸多问题，严重的制约着酸菜的工业化发展[1-4]。

乳酸菌（lactic acid bacteria）是泡菜发酵过程中的优势菌群，对酸菜风味的形成具有重要意义[5-7]。果蔬中的亚硝酸盐对人体的健康有潜在影响，在低盐泡菜发酵过程中，乳酸菌分泌的有机酸及细菌素可抑制病原菌生长[8-9]。一些乳酸菌作为益生菌，对人体健康有益，如明串珠菌（Leuconostoc）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）等，特别是植物乳杆菌，很可能明显降低泡菜中N-亚硝基二甲胺及其前体物质（亚硝酸盐、二甲胺、生物胺等）的含量[10-12]。

在酸菜的制作过程中加入甜米酒后，可增强酸菜的口感及风味[13-14]，从传统优良酸菜中分离的优势乳酸菌株，通过响应面设计制作出低亚硝酸盐含量、品质稳定且风味俱佳的甜米酒酸菜，为传统酸菜的改造及甜米酒酸菜的加工提供一定理论和应用依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）FY1、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）FY2：分离自云南富源酸菜，本实验室4℃斜面保存。

1.1.2 原料

青菜、甜米酒（酒精度0.5%vol）、白萝卜、食盐、白砂糖、红辣椒粉、茴香粉：市售。

1.1.3 试剂

亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、硼酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；亚硝酸盐标准液：广州威佳科技有限公司。

1.1.4 培养基

MRS液体培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

种子培养基：500 g白萝卜加入200 mL水榨汁，4层纱布过滤取滤液，滤液加入5%的蔗糖，121℃灭菌15 min，得种子培养基。

1.2 仪器与设备

AE100S电子分析天平：梅特勒托利多仪器有限公司；722s分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸菜的工艺流程及操作要点

操作要点：

清洗、晾晒：去除老叶、烂叶，清水洗净青菜，并晾晒至失水率40%左右即可。

切碎：将处理好的青菜切为2 cm宽。

菌种活化：将FY1与FY2分别各挑取两环至MRS液体培养基中，于37℃培养48 h后活化。

种子液：两株乳酸菌分别按3%的接种量接入种子培养基，在37℃培养48 h得到种子液。将种子液含菌量分别调至4.0×107～5.0×107CFU/mL于4℃冷藏备用。

调味：将切好的青菜与配料（食盐、白砂糖、甜米酒等）混合搅拌均匀。

装瓶、发酵：将瓶子煮沸5 min进行杀菌消毒，装瓶时将材料压实，室温条件下进行厌氧发酵。

1.3.2 甜米酒酸菜发酵工艺优化单因素试验

分别考察乳酸菌添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、乳酸菌添加比例（FY1∶FY2=1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）、发酵时间（3 d、6 d、9 d、12 d、15 d）、食盐添加量（0、2%、4%、6%、8%）、白砂糖添加量（0、2%、4%、6%、8%）、甜米酒添加量（0、5%、10%、15%、20%）6个因素对甜米酒酸菜中总酸含量、亚硝酸盐含量及感官评分的影响。

1.3.3 Plackett-Burman试验设计

Plackett-Burman（PB）设计，用于中心组合试验前挑选优化因素。在单因素试验的基础上，结合文献[15]，进行PB设计（N=12），以感官评分为评价指标，考察发酵时间（A）、食盐添加量（B）、白砂糖添加量（C）、甜米酒添加量（D）4个因素对甜米酒酸菜感官评分的影响，PB试验设计因素与水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

1.3.4 甜米酒酸菜发酵工艺优化的响应面试验

试验采用Box-Behnken设计，研究食盐添加量（X1）、白砂糖添加量（X2）、甜米酒添加量（X3）对甜米酒酸菜感官评分的影响，选取最优配方。响应面试验因素与水平如表2。

表2 甜米酒酸菜工艺优化的响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology for fermentation technology optimization of pickle with sweet rice wine

1.3.5 测定方法

（1）感官评定

酸菜成熟后，请10名专业人员对甜米酒酸菜从4个方面进行感官评分，满分100分，结果取平均值，感官评分标准如表3。

表3 甜米酒酸菜感官评定标准Table 3 Sensory evaluation standard of pickle with sweet rice wine

（2）理化指标的测定

亚硝酸盐含量：参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[17]中的方法进行测定；总酸含量：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[18]中酸碱滴定法测定。

总砷、无机砷、铅、糖精钠、山梨酸、苯甲酸、合成着色剂：根据GB/T 5009.54—2003《酱腌菜卫生标准的分析方法》[19]中的方法测定。

（3）微生物指标的测定

大肠菌群、致病菌（金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌）：根据GB 2714—2015《食品安全国家标准酱腌菜》[20]进行测定。

2 结果与分析

2.1 甜米酒酸菜发酵工艺优化单因素试验

2.1.1 乳酸菌添加量对甜米酒酸菜感官及理化指标的影响

将乳酸菌添加量分别设定为1%、2%、3%、4%、5%，乳酸菌添加比例为1∶1，食盐添加量4%，白砂糖添加量6%，甜米酒添加量10%，自然条件下发酵10 d，得到成熟的酸菜后，考察不同乳酸菌添加量对甜米酒酸菜的影响，结果见图1。

图1 不同乳酸菌添加量对甜米酒酸菜品质的影响Fig.1 Effect of different lactic acid bacteria addition on the quality ofpickle with sweet rice wine

由图1可看出，随着乳酸菌添加量的增加，甜米酒酸菜的亚硝酸盐含量呈下降的趋势，从添加量为1%时的6.28 mg/kg降至添加量为3%时的1.52 mg/kg，之后趋于稳定，虽然乳酸菌添加量为1%～3%时亚硝酸盐含量有显著性差异（P＜0.05），但均低于我国卫生标准（20 mg/kg）；不同乳酸菌添加量条件下甜米酒酸菜的总酸含量基本稳定，添加量为2%时总酸含量最低，为2.12 g/100 g，添加量为5%时总酸含量最高，为3.58 g/100 g；甜米酒酸菜的感官评分随着乳酸菌添加量的增加呈先上升后下降的趋势，乳酸菌添加量为3%时感官评分达到最高，为87.5分；因此，选择最适乳酸菌添加量为3%。

2.1.2 乳酸菌添加比例对甜米酒酸菜感官及理化指标的影响

将乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）分别设定为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，乳酸菌添加量3%，其他条件同2.1.1，结果见图2。

图2 不同乳酸菌添加比例对甜米酒酸菜品质的影响Fig.2 Effect of different lactic acid bacteria ratio on the quality of pickle with sweet rice wine

由图2可看出，甜米酒酸菜的亚硝酸盐含量在FY1∶FY2为1∶2时最低为1.59 mg/kg，FY1∶FY2为2∶1时亚硝酸盐含量最高为4.22 mg/kg；不同乳酸菌添加比例条件下甜米酒酸菜的总酸含量没有明显变化，均处于3.02～3.32 g/100 g；甜米酒酸菜感官评分在FY1∶FY2为1∶2时最高，为88.4分，总体变化差异不显著（P＞0.05）。两种乳酸菌混合发酵可以增加酸菜风味，乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）为1∶2时，甜米酒酸菜的感官评分最高，亚硝酸盐含量最低，因此，选择最适乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）为1∶2。

2.1.3 发酵时间对甜米酒酸菜的感官及理化指标的影响

将乳酸菌添加量设定为3%，添加比例（FY1∶FY2）为1∶2，其他条件同2.1.1，自然条件下分别发酵3 d、6 d、9 d、12 d、15 d，考察不同发酵时间对甜米酒酸菜品质的影响，结果见图3。

图3 不同发酵时间对甜米酒酸菜品质的影响Fig.3 Effect of different fermentation time on the quality of pickle with sweet rice wine

由图3可知，随着发酵时间的延长，亚硝酸盐含量先上升，第6天达到最高，为8.45 mg/kg，随后显著下降，9 d后趋于稳定；总酸在整个发酵过程中呈缓慢上升趋势，从2.37 g/100 g增加至3.88 g/100 g，但总体变化不显著（P＞0.05）；感官评分随发酵时间的延长而上升，从第3天的65.8分显著上升（P＜0.05）至第9天的88.4分，之后虽然有些许下降但差异不显著。发酵至第9天时，亚硝酸盐含量相对较低，感官评分最高，因此，选择最适发酵时间为9 d。

2.1.4 食盐添加量对甜米酒酸菜感官及理化指标的影响

将食盐添加量分别设定为0、2%、4%、6%、8%，乳酸菌添加量3%，乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）为1∶2，白砂糖添加量6%，甜米酒添加量10%，自然条件下发酵9 d，考察不同食盐添加量对甜米酒酸菜品质的影响，结果见图4。

由图4可知，发酵过程中，小部分的盐可能会转化成为亚硝酸钠而增加亚硝酸盐的含量，随着食盐添加量的增加，甜米酒酸菜的亚硝酸盐含量整体呈先上升后下降趋势，从1.13 mg/kg升至2.02 mg/kg，最后降至1.84 mg/kg，但总体变化无显著性差异（P＞0.05）；总酸随着食盐添加量的增加缓慢增加，从3.07 g/100 g升至3.58 g/100 g，总体变化不显著（P＞0.05）；感官评分随食盐添加量的增加急剧上升后急剧下降，最高达到85.9分；因此，选择最适食盐添加量为4%。

图4 不同食盐添加量对甜米酒酸菜品质的影响Fig.4 Effect of different salt addition on the quality of pickle with sweet rice wine

2.1.5 白砂糖添加量对甜米酒酸菜感官及理化指标的影响

将白砂糖添加量分别设定为0、2%、4%、6%、8%，乳酸菌添加量3%，乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）为1∶2，食盐添加量4%，甜米酒添加量10%，自然条件下发酵9 d，考察白砂糖添加量对甜米酒酸菜品质的影响，结果见图5。

图5 不同白砂糖添加量对甜米酒酸菜品质的影响Fig.5 Effect of different sugar addition on the quality of pickle with sweet rice wine

由图5可看出，甜米酒酸菜中的亚硝酸盐含量及总酸含量均趋于稳定，无显著性差异（P＞0.05）；感官评分随白砂糖添加量的增加而显著上升（P＜0.05），从60.1分上升至88.5分后显著下降至76.2分（P＜0.05），因此，选择最适白砂糖添加量为6%。

2.1.6 甜米酒添加量对甜米酒酸菜感官及理化指标的影响

将甜米酒添加量分别设定为0、5%、10%、15%、20%，乳酸菌添加量3%，乳酸菌添加比例（FY1∶FY2）为1∶2，食盐添加量4%，白砂糖添加量6%，自然条件下发酵9 d，考察甜米酒添加量对甜米酒酸菜品质的影响，结果见图6。

由图6可看出，甜米酒酸菜的亚硝酸盐含量及总酸含量变化无显著性差异（P＞0.05）；感官评分随着甜米酒添加量的增加而显著上升（P＜0.05），从62.3分上升至82.0分后显著下降至78.6分（P＜0.05），故选取15%为最适添加量。

图6 不同甜米酒添加量对甜米酒酸菜品质的影响Fig.6 Effect of different sweet rice wine addition on the quality of pickle with sweet rice wine

2.2 Plackett-Burman试验设计

按PB试验设计进行试验，PB试验设计与结果见表4，各因素主效应分析试验结果如表5所示。

表4 Plackett-Burman试验设计与结果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

表5 Plackett-Burman试验的效应分析Table 5 Effect analysis of Plackett-Burman experiments

由表4、表5可知，4个因素中重要性最大的3个因素分别是食盐添加量（B）、甜米酒添加量（D）和白砂糖添加量（C），其中食盐添加量对感官评分影响极显著（P＜0.01），甜酒添加量、白砂糖添加量对结果影响显著（P＜0.05）。因此，选择食盐添加量、白砂糖添加量和甜米酒添加量作为主要影响因素进行进一步的响应面分析。

2.3 酸菜最佳配方的筛选

2.3.1 甜米酒酸菜发酵工艺优化响应面试验

以感官评分（Y）为评价指标，选取食盐添加量（X1）、白砂糖添加量（X2）、甜米酒添加量（X3）3个影响显著的因素，采用Box-Behnken设计进行响应面优化设计，试验设计与结果见表6，回归模型的方差分析结果见表7。

表6 甜米酒酸菜发酵工艺优化响应面试验设计及结果Table 6 Design and results of response surface experiments for fermentation technology optimization of pickle with sweet rice wine

表7 回归模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

使用Design-Expert8.0.6进行回归拟合分析，得到二次回归拟合方程为：

由表7可知，模型差异极显著（P＜0.01），失拟不显著（P＞0.05），说明所得模型拟合度良好。相关系数R2=0.986 3，调整决定系数R2adj为0.968 6，说明此模型能较准确且真实地模拟、预测甜米酒酸菜的发酵工艺条件。

2.3.2 响应面结果分析与验证

食盐添加量（X1）、白砂糖添加量（X2）、甜米酒添加量（X3）交互作用对甜米酒酸菜感官评分影响的响应曲面及等高线如图7所示。

图7 食盐添加量、白砂糖添加量、甜米酒添加量交互作用对甜米酒酸菜感官评分影响的响应曲面及等高线Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interactions between salt addition,sugar addition,sweet rice wine addition on sensory evaluation score of pickle with sweet rice wine

由图7可知，各因素间交互作用的响应面均呈抛物面，开口均向下，有极大值点；其中交互作用X1X2、X1X3的等高线呈椭圆形，对结果影响显著（P＜0.05）。

通过响应面优化设计分析，确定甜米酒酸菜的最适宜发酵工艺为食盐添加量4.01%，白砂糖添加量6.23%，甜米酒添加量15.55%，感官评分预测值为91.62分。为便于操作，对优化后试验条件适当调整为食盐添加量4.0%，白砂糖添加量6.2%，甜米酒添加量15.6%；在此条件下进行验证试验，感官评分为92.3分，与预测结果相近，具有参考价值。

2.4 甜米酒酸菜质量评价

甜米酒酸菜亚硝酸盐含量为1.34 mg/kg，总酸含量（以乳酸计）为3.23 g/100 g，总砷及无机砷、铅、糖精钠、山梨酸、苯甲酸、合成着色剂均未检测出。细菌总数为5.4×105CFU/g，大肠菌群为0 MPN/g，致病菌未检出。理化及卫生指标均符合国家相关标准。

3 结论

通过单因素试验、PB试验及Box-Behnken设计，得出甜米酒酸菜发酵工艺的最优条件为食盐添加量4.0%，白砂糖添加量6.2%，甜米酒添加量15.6%，在室温条件下发酵9 d。按照优化所得配方制作出的甜米酒酸菜成品感官评分为92.3分；清香味美，解腻开胃，品质稳定，更便于工业生产。