止血祛瘀明目片在非缺血型视网膜静脉阻塞中的作用机制研究

韩治华 ，吴沂旎 ，王芳 ，吴雪梅 ，冀璐 ，杨淑焕

中国传统医学认为视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）属“络损暴盲”“血症”范畴，临床表现为突然出现不同程度的视物障碍，眼底表现为血管周围片状的出血，重者可致盲。中医对RVO的研究多认为“血瘀”“血虚”“痰瘀”是其主要证候。西医认为RVO是以视网膜血管闭塞，进而引发视网膜缺血缺氧及网膜无灌注的一种缺血性视网膜疾病。目前认为炎症在其致病中的作用越来越明显。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前公认的血管生成因子及血管通透性分子。其在RVO中的作用尚不清楚。止血祛瘀明目片是由约15种中草药组成的一种中药制剂，其中黄苓、牡丹皮、夏枯草具有清肝明目、清热解毒等作用。已有研究提示止血祛瘀明目片在RVO中可改善视网膜血管闭塞及缺血情况，且治疗后房水中炎性因子水平显著降低[1]。但止血祛瘀明目片如何发挥作用及其分子信号通路目前尚不清楚。本研究对RVO患者采用止血祛瘀明目片联合卵磷脂络合碘进行治疗，深入探讨其作用机制具有重要的临床意义。

1 对象与方法

1.1 一般资料

收集2014年9月—2018年5月陕西省中医医院眼科收治的92例非缺血型视网膜静脉阻塞患者，因失访脱落7例，最终纳入85例符合纳排标准的患者，男 39例，女 46例；年龄 40～80岁，平均（61.9±9.5）岁；病程 3～35 d，平均（10.6±4.7） d。随机方法分为2组，治疗组最终45人（45只眼），其中男 20例，女25例；年龄43～82岁，平均年龄（61.9±9.5）岁；对照组最终纳入40例（40只眼），其中男19例，女 21例；年龄 25～73 岁，平均年龄（61.4±9.7）岁。病程3～35 d。两组患者一般临床资料间差异没有统计学意义。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准[2-4]（1）主要症状及体征：①视力不同程度下降，多为单眼发病；②眼底检查示视网膜静脉迂曲扩张，沿病变静脉区有视网膜出血、渗出及水肿等，可伴有视乳头水肿充血、边缘模糊；③眼底荧光血管造影可见静脉充盈时间延迟，病变区荧光渗漏，毛细血管迂曲扩张，可出现无灌注区及新生血管。（2）根据阻塞程度可分为缺血型和非缺血型（表 1）。

表1 视网膜静脉阻塞分型标准

1.2.2 瘀血伤络，阴虚内热证中医辨证依据[2,5]（1）瘀血伤络，阴虚内热证：主症，视物不清；次症，目睛干涩，视物变形、头晕耳鸣，口咽干燥；舌脉，舌暗红，少苔，脉弦细。主症视物不清必备，次症2项或以上，参考舌脉即可诊断。（2）中医症状评分标准见表2。

1.3 纳入标准

（1）符合非缺血型视网膜中央静脉阻塞西医诊断标准者，且伴有黄斑水肿的患者；（2）符合中医证候瘀血伤络，阴虚内热证辨证标准者；（3）发病在3个月以内的患者 （不含3个月）；（4）年龄35～75岁。

表2 中医症状评分标准表

1.4 排除标准

（1）伴有角膜混浊、角膜散光等对视力有影响的眼部疾病者；（2）既往有眼部手术史及前房浅、房角窄者；（3）合并严重肝、肾功能不全者；（4）妊娠及哺乳期妇女；（5）过敏体质患者；（6）未签署知情协议书者。

1.5 研究方法

1.5.1 用药方法及所用试剂 止血祛瘀明目片(由陕西摩美得气血和制药有限公司生产），薄膜衣每片重0.3 g。卵磷脂络合碘片（由日本第一药品产业株式会社生产）1.5 mg/片。 兔抗人多克隆抗体 NF-κB（1:5000）及兔抗人单克隆抗体 VCAM-1（1:1000）均购自英国abcam公司。

1.5.2 治疗方法 两组所有患者均给予静滴注射用血栓通300 mg/d，及神经营养剂（小牛血清去蛋白注射液）0.8 g/次，1次/d，作为基础治疗。对照组患者口服卵磷脂络合碘片，1.5 mg/次，3次/d。治疗组患者在对照组基础上口服止血祛瘀明目片，每次5篇，每日3次。两组患者均连续治疗12周。

1.6 观察指标

1.6.1 视力检查 采用国际标准视力表检查患者治疗前后最佳矫正视力，以小数记录,治疗期每4周记录1次。

1.6.2 眼底出血面积的改善 散瞳后行眼底镜检查及眼底照相，记录出血部位及面积，折合成视盘直径（PD)计算，观察精确度至1/5 PD,治疗期每4周记录1次。比较两组患者在治疗前后变化情况。

1.6.3 中医证候 采集患者中医证候材料，分别于治疗前、试验4周、试验8周、试验12周进行采集。

1.6.4 血清VEGF、IL-6和IL8水平 采用酶联免疫吸附实验法检测两组患者治疗前后血清中VEGF、IL-6和IL-8水平。分别在治疗前和治疗12周时抽取两组患者血清，用双抗夹心ELISA法检测血清中VEGF、IL-6和IL-8的含量。

1.6.5 NF-κB及VCAM-1的蛋白表达 采用Western blot检测，分别于治疗前和治疗12周时抽取两组患者血清，用血清总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，用BCA法测定总蛋白浓度，通过SDS-PAGE凝胶电泳，转膜、封闭抗体ECL化学发光，用β-actin的表达作为内参照进行比较，测定目的蛋白条带密度灰度值与内参蛋白条带密度灰度值的比值，即为目的蛋白相对灰度值。

1.7 疗效指标

1.7.1 视力改善情况 显效：视力提高4行及以上或达到1.0；有效：视力提高2行；无效：视力无变化或下降。注：双眼发病者评价右眼。按照国际标准视力表1分制进行记录；0.1以下视力增加档次按以下方法计算：无光感、光感、手动、数指/33 cm、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1.增加 2行为有效；增加 4行及以上为显效。

1.7.2 眼底出血疗效 临床治愈：视力恢复1.0以上，或恢复至发病前视力，眼底出血基本吸收，眼底血管荧光造影基本正常；显效：视力提高4行以上，眼底出血量大部分吸收（1/2～2/3面积），眼底血光荧光造影明显改善；有效：视力提高2～3行以上，眼底出血量大部分吸收（1/3～1/2面积），眼底血光荧光造影有所改善；无效：视力无变化或下降，眼底出血无变化或增多，眼底血光荧光造影无变化或恶化[6]。

1.7.3 中医证候总积分评价标准[6]临床痊愈：中医证候积分减少≥95%；显效：中医证候积分减少≥70%；有效：中医证候积分减少≥30%；无效：中医证候积分减少不足30%。疗效指数n=[（疗前总积分-疗后总积分）/疗前总积分]×100%。

1.8 统计学方法

采用SPSS22.0统计分析软件，计量资料将采用均数±标准差（x¯±s）表示，两组间比较采用独立样本 t检验，组内治疗前后比较采用配对t检验。两组间等级定性资料采用Kruskal-Wallis H检验。统计检验均采用双侧检验，P＜0.05为检验有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者不同时间点视力比较

两组患者视力水平发现治疗后均比治疗前显著提高，治疗组随治疗时间的延长视力逐步恢复，且治疗8周后视力提高显著，对照组视力变化趋势同治疗组，但同一时间两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。（表 3）

表3 两组患者治疗前后视力比较（x¯±s）

2.2 眼底出血面积

眼底出血面积消退，总疗效分析，治疗组总有效率为80.0%，对照组总有效率为52.5%，两组比较有统计学意义（χ2=4.370，P=0.037）。 （表 4）

表4 两组眼底出血总疗效[例数（%）]

2.3 中医证候疗效

中医证候疗效分析，治疗组总有效率为84.4%，对照组总有效率为55.0%，两组比较有统计学意义（χ2=6.403，P=0.011）。 （表 5）

表5 两组中医证候疗效分析

2.4 两组血清VEGF、IL-6和IL-8水平比较

两组患者血清中VEGF、IL-6和IL-8水平检测发现治疗后均比治疗前显著降低，两组治疗前后相比差异具有统计学意义（P＜0.05），且各个指标治疗组的效果显著优于对照组，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。（表 6）

表6 两组血清学指标比较（x¯±s）

2.5 两组蛋白水平比较

两组患者血浆中NF-κB及VCAM-1蛋白水平检测发现治疗后二者的蛋白水平显著下调，与治疗前相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），且各个指标治疗组的效果显著优于对照组，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。 （图 1、表 7）

图1 治疗组和对照组NF-κB和VCAM-1蛋白水平治疗前后比较。CG对照组；EG治疗组

3 讨论

血管内皮生长因子（VEGF)是目前公认的血管生成因子及血管通透性分子。其主要功能是内皮细胞增生、迁移及血管腔的形成，是一种慢性炎症过程。Jung、Fonollosa及艾华等发现在RVO患者的房水及玻璃体中发现VEGF的明显增高，且炎性相关因子如TNF-α、IL-6等水平也相应升高，且RVO的严重程度与其浓度显著相关，因此推测炎症可能参与VEGF诱导的视网膜新生血管的发生[7-9]。我们的研究发现RVO患者治疗前血浆中的VEGF的水平显著升高，治疗后明显下调，同时发现炎性相关因子IL-6及IL-8水平在治疗后水平也明显下降，说明VEGF及炎症均参与了RVO的发病，同以往研究结果一致。

止血祛瘀明目片是由陕西摩美得气血和制药有限公司生产，该方中赤芍、墨旱莲、大黄具有清热、凉血止血；丹参、茺蔚子、三七具有活血通络，祛瘀散血、消痈等作用；黄芩（酒炙）、牡丹皮、毛冬青和夏枯草具有抗炎作用，研究发现黄芩苷可显著抑制大鼠腹腔白细胞细胞内白三烯B4、白三烯C4的生物合成，还可显著抑制人工三肽(fMLP)激发的白细胞内Ca2+升高，并促进细胞内cAMP水平提高，表明黄芩苷显著影响白细胞的多种功能并揭示了其抗炎的作用机理［10］。唐健青等[1]、宋丽君等[11]研究发现在 RVO中治疗组 （口服止血祛瘀明目片+卵磷脂络合碘）3个月后患者视力较对照组（口服卵磷脂络合碘）明显提高，且FFA显示视网膜循环状态恢复正常，视网膜出血显著吸收，提示患者视网膜血管闭塞及缺血情况改善，进一步发现治疗组房水中VEGF水平较治疗前显著降低，优于对照组，差异有统计学意义。我们的研究发现RVO患者治疗后血浆中的VEGF和炎性相关因子IL-6及IL-8水平的水平显著下降，且同治疗前相比有统计学意义，同以往研究结果一致。然而止血祛瘀明目片如何下调VEGF、IL-6及IL-8因子其抗炎的作用机制是那些呢？

NF-κB是一个多效的转录因子，其受氧化应激、细胞因子等多种刺激而激活，能调控炎症性细胞因子、转录因子及粘附因子，进而参与微循环障碍的发生发展。血管内皮细胞粘附分子(Ascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)主要表达于血管内皮细胞,通过白细胞粘附、跨膜运动参与血管内皮细胞功能紊乱导致血瘀症相关疾病的发生。因此我们进一步检测了NF-κB及VCAM-1蛋白水平，明确在RVO的发病机制及止血祛瘀明目片的作用机制。我们的研究发现，治疗前NF-κB及VCAM-1的蛋白表达水平明显增高，两组间没有显著差异，而治疗后NF-κB的VCAM-1蛋白表达显著下调，且与治疗前相比差异有统计学意义，提示我们止血祛瘀明目片发挥作用是通过下调NF-κB，进一步调控炎症因子IL-6/IL-8的水平，最终影响VCAM-1的表达，进而在RVO中发挥作用的。即明确了VEGF/NF-κB/IL-6/IL-8/VCAM-1信号通路。细菌脂多糖刺激人脐静脉内皮细胞后 4 h、8 h 发现,炎性因子 NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,VCAM-1均显著增加,提示细菌脂多糖通过内皮细胞表达炎性细胞因子,进而导致脓毒症中的炎症反应[12]，这与我们的研究结果一致。

综上所述，止血祛瘀明目片对非缺血型视网膜静脉阻塞具有突出疗效，有扩张血管、增加血流量，改善微循环的作用，能促进侧支循环的建立，有利于视功能恢复。