苦荞麦种子与幼苗对叠氮化钠诱变的响应

刘建霞 张梦丽 李慧 温日宇

摘要：用叠氮化钠对苦荞麦种子进行诱变，确定叠氮化钠的最佳诱变剂量和时间，检测诱变后幼苗的生理指标。以晋荞2号种子为材料，用不同浓度梯度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mmol/L）的叠氮化钠分别处理4、8、12 h，探讨苦荞麦种子的发芽率和相对发芽率。同时，对幼苗的丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）及过氧化物酶（POD）的活性进行检测。结果表明，叠氮化钠的浓度为0.8 mmol/L、诱变时间为8 h时，苦荞麦种子发芽率为49%，相对发芽率为51.04%，接近半致死浓度。叠氮化钠在低浓度时，苦荞麦叶片的SOD、POD活性均升高，高浓度时，活性则有所下降。当叠氮化钠浓度为0.6 mmol/L时，SOD活性达到最大值，当叠氮化钠浓度为0.8 mmol/L时，POD活性达到最大值。综合分析可知，叠氮化钠浓度为0.8 mmol/L、处理时间为8 h为最佳诱变组合。

关键词：叠氮化钠;诱变;苦荞麦

中图分类号： Q945.34;S517.01  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0085-03

苦荞麦[Fagopyrum tataricum （L.） Gaertn]属蓼科荞麦属双子叶植物，又称万年荞、野南荞等[1]，种子外形较长，为三棱形，头部棱角明显、尖锐，底部较圆，外表光滑，为灰黑色或黑褐色，没有光泽[2]。苦荞麦的生长适应性强，具有耐干旱、耐寒冷、耐酸碱、耐贫瘠以及生育期短的特点，主要分布在西南山区、云贵高原、陕西、山西等地，是我国传统的小杂粮之一[3]。苦荞麦的营养价值十分丰富，蛋白质、维生素、微量元素的含量均比其他作物高，开发前景非常广阔[4];此外，苦荞麦还具有较高的药用价值，可以治疗胃痛、消化不良、腰腿疼痛、跌打损伤，《本草纲目》中记载：苦荞麦的性味苦、平、寒，具有益气力、续精神、利耳目、宽肠健胃的作用[5]。临床研究表明，苦荞麦能够降低血糖血脂，能有效地预防和治疗糖尿病。

目前对荞麦研究最多的是苏联，其次是日本、波兰、南斯拉夫及加拿大[6]。我国荞麦品种多，资源丰富，但是荞麦科研起步比较晚，育种技术也比其他作物落后，荞麦不仅产量低而且很不稳定，品种多而乱，退化严重，影响了我国荞麦在国际市场的竞争力[7]。随着人们对苦荞麦营养、保健及药用价值研究的深入，对苦荞麦开发利用力度加大，苦荞麦也渐渐被人们接受，市场上对苦荞麦的需求量也不断加大，因此，培育高产、优质、抗逆性强、适应性广、符合人们要求的苦荞麦新品种迫在眉睫[8]。

叠氮化钠（NaN3）是一种常见的化学诱变剂，具有使用效率高、毒性小、价格低廉、容易获得、对M1的生理损伤小等优点[9]。其等电点pH值为4.18，当用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH值为3，现用现配）溶解叠氮化钠时，NaN3在溶液中主要产生HN3分子，表现为中性，细胞膜不能将其截留，可以透过细胞膜进入细胞质中，按照碱基替换的方式来影响DNA的正常合成，导致点突变的产生[9]，从而导致基因发生突变，获得新的变异品种。目前利用叠氮化钠进行诱变育种的研究较多，在大豆[10]、大麦[11]、小麦[12]等作物上均有应用，而在苦荞麦诱变育种方面的研究较少，因此，本研究以苦荞麦种子为材料，利用不同浓度叠氮化钠对其進行诱变研究，探究种子发芽率及幼苗生理指标的变化，找出叠氮化钠半致死浓度，获得最佳诱变浓度与诱变时间组合，以此对苦荞麦进行快速的遗传改良，为获得高产优质的苦荞麦新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2017年3月在山西大同大学生命科学学院细胞工程实验室进行。材料为山西当地苦荞麦品种晋荞2号，来源于山西省农业科学院玉米研究所。

1.2 方法

（1）将种子倒入有水的塑胶盆中洗涤数遍，以除去种子表面的灰尘，同时除去水面上漂浮的劣质种子以及草籽等，然后从中选取颗粒饱满的苦荞麦种子约6 000粒，将其放入大烧杯中，加入清水在室温下浸泡约14 h[13]。然后进行种子消毒处理，具体方法如下：在无菌条件下，用75%乙醇浸泡 30 s，然后置于0.1%氯化汞溶液中处理12 min，最后用无菌水漂洗 5～6次，待用[14];将处理好的种子放入20个锥形瓶中，每个锥形瓶100粒，分别用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mmol/L 叠氮化钠处理4、8、12 h，每个锥形瓶中加入 20 mL 诱变剂，以磷酸缓冲液（pH值为3）处理为对照（CK），然后以同样的方法将每个诱变处理做2组重复，以保证试验结果的可靠性[13]。为了去除种子上残留的叠氮化钠溶液，需要用硫代硫酸钠作终止剂对其进行终止诱变处理，具体方法如下：将锥形瓶中的叠氮化钠诱变剂倒入1个固定容器中，然后加入10 mL 0.1 mol/L Na2S2O3·5H2O洗涤15 min，再用清水对其冲洗5 min[13];处理完成后，将种子转移到培养皿中，皿内要铺上2层滤纸以保持湿润，然后将其放入25 ℃恒温培养箱中进行培养，定期观察并统计发芽的种子数[15]，调查7 d时的发芽率。

（2）丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性的测定参考《植物生理学实验指导》[16]。

1.3 数据处理

采用Excel和SPSS 23对试验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 叠氮化钠处理对苦荞麦发芽率、相对发芽率的影响

由表1可知，叠氮化钠同一处理时间内随着处理浓度的增大，各组之间发芽率和相对发芽率均存在显著差异（P<0.05）。处理时间为4 h时，对照和0.2 mmol/L之间发芽率差异未达到极显著水平，0.6 mmol/L和0.8 mmol/L之间发芽率差异未达到极显著水平，其余各组之间发芽率均存在极显著差异（P<0.01）;除对照和0.2 mmol/L外，其余各组之间相对发芽率均存在极显著差异（P<0.01）。处理时间为 8 h 时，除0.6、0.8 mmol/L外，其余各组之间发芽率和相对发芽率均存在极显著差异（P<001）。处理时间为12 h时，各组之间发芽率和相对发芽率均存在极显著差异（P<0.01）。随着叠氮化钠处理时间和浓度的加大，苦荞麦的发芽率整体呈现出下降的趋势，当叠氮化钠的浓度为1.5 mmol/L、处理时间为 12 h 时，发芽率由原来的94%降到3%，种子的相对发芽率也呈现出下降的趋势，当叠氮化钠处理浓度达到 1.5 mmol/L、处理时间为12 h时，其相对发芽率由100.00%降到3.19%。在同一浓度下，随着诱变时间的延长，苦荞麦种子相对发芽率也表现为下降的趋势，说明随着处理浓度和处理时间的增加，苦荞麦种子受损伤的程度也不断加大，当叠氮化钠浓度为 0.8 mmol/L、时间为8 h时，苦荞麦种子发芽率为49%，相对发芽率为51.04%，因此得出叠氮化钠最适宜的诱变组合为浓度0.8 mmol/L、时间8 h。

2.2 叠氮化钠处理对苦荞麦幼苗生理指标的影响

2.2.1 不同浓度叠氮化钠处理下苦荞麦叶片MDA含量的变化 对MDA含量的测定结果如图1所示，可以得出，对照MDA含量为0.667 μmol/L，而叠氮化钠浓度为 1.5 mmol/L时，MDA含量为1.654 μmol/L，是对照的 2.48倍。相比于对照，处理组的MDA含量总体都在升高，除0.2 mmol/L叠氮化钠浓度时与对照差异不显著，其余各组均与对照有显著差异（P<0.05），随着处理浓度的增大，各相邻浓度梯度之间并无显著差异，说明MDA含量随处理浓度的增大而增加，但各组之间增加量不多，总体趋势较为平缓，但相比于对照，MDA含量增加的量越来越大，趋势也越来越明显。

2.2.2 不同浓度的叠氮化钠处理下苦荞麦叶片SOD活性的变化 由图2可以看出，对照的SOD活性为48.28 U/g，随着处理浓度的升高，苦荞麦叶片中SOD活性也随之升高，在叠氮化钠浓度为0.6 mmol/L时，SOD活性为131.84 U/g，达到最大值，而后随着处理浓度的继续增大，SOD活性则慢慢减弱，在叠氮化钠浓度为1.5 mmol/L时，SOD活性下降到6543 U/g。因此可知，叠氮化钠在低浓度时苦荞麦叶片SOD活性升高，高浓度时苦荞麦叶片SOD活性下降，在浓度为04、0.6、0.8 mmol/L时相较于对照差异极显著（P<0.01）。

2.2.3 不同浓度的叠氮化钠处理下苦荞麦叶片POD活性的变化 如图3所示，POD活性变化与SOD活性变化趋势相一致，对照POD活性为19.61 U/g，而在叠氮化钠处理浓度为 0.8 mmol/L 时POD活性为76.92 U/g，达最大值，随后POD活性逐渐降低，在叠氮化钠浓度为1.5 mmol/L时POD活性下降为29.93 U/g。由此可知，叠氮化钠在低浓度时苦荞麦叶片POD活性上升，高浓度时苦荞麦叶片POD活性下降，在浓度为 0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L时与对照差异极显著（P<0.01）。

3 结论与讨论

3.1 叠氮化钠对苦荞麦种子发芽的最佳诱变浓度和时间

关于叠氮化钠对种子发芽的影响，国内外学者不断进行了研究。目前，作为一种常见的诱变剂，很多资料显示，叠氮化钠对作物有很高的诱变潜力，其应用于大麦、水稻、蚕豆、高粱等作物并且得到了范围相当广泛的突变谱以及相当高的突变频率[17]。本试验中以晋荞2号为试验材料，探究叠氮化钠处理对苦荞麦种子发芽的影响，与叠氮化钠对一些不同种属作物研究的结果相比，其最佳诱变浓度和诱变时间都有一定的差异。杨国志等对西瓜的诱变育种研究认为，叠氮化钠浓度为1.5 mmol/L、诱变时间为1.5 h时，诱变效果最佳[18];陆兆新等对水稻种子诱变的研究表明，叠氮化钠浓度为 1 mmol/L、诱变时间为12 h时，其诱变效应最为明显[19];张会灵等对辣椒种子的诱变研究表明，叠氮化钠浓度为 4 mmol/L、诱变时间为4 h时效果最佳[20]。而叠氮化钠作用于蓼科植物的研究还比较少，在蓼科植物的诱变育种研究中，有关于诱变剂EMS（甲基磺酸乙酯）对头花蓼的研究，结果表明，在EMS浓度为 0.6%、诱变时间为24 h或者EMS浓度为0.8%、诱变时间为12 h时，达到半致死条件[21]。本试验对苦荞麦的研究结果表明，随着诱变剂浓度的升高，苦荞麦种子的发芽率、相对发芽率均有所降低，发芽时间有所延长，在叠氮化钠浓度为 0.8 mmol/L、诱变时间为8 h时为最佳的诱变组合，在此浓度下，种子发芽率达到49%，相对发芽率为5104%，因此认为叠氮化钠浓度为0.8 mmol/L时是苦荞麦种子诱变的半致死浓度，最佳诱变时间为8 h。

3.2 叠氮化钠对苦荞麦幼苗MDA含量和SOD、POD活性影响的分析

叠氮化钠对种子发芽及幼苗生长的影响与逆境环境对种子的影响很相似，抗氧化酶活性的变化与幼苗在逆境条件下的应对反应也一致，叠氮化钠浓度过大时，可能直接破坏种子的抗性机制，使幼苗体内抗氧化酶活性发生变化[22]。植物器官在逆境中，由于自由基对其造成的损害而会使植物器官发生膜脂的过氧化作用，生物膜中的不饱和脂肪酸分解后能产生MDA，可以和蛋白质结合，使膜中的结构蛋白和酶进行聚合、交联，形成不可溶的化合物（脂褐素）沉积，因此能够对质膜系统造成进一步的伤害[23]。通过MDA含量的测定结果可以得出，相比于对照，处理组的MDA含量总体都是在升高的，而且随着处理浓度的增大，MDA含量上升的量越来越多，趋势越来越明显，这就表明脂膜受到了损伤，而且诱变剂浓度越高，其受到的损伤越大。植物抗氧化系统中的重要酶类包括SOD、POD，在正常的条件下，这些酶能够有效地将体内的活性氧自由基清除掉，以保护细胞免受伤害，但是在逆境条件下，植物清除活性氧的能力低于植物体内活性氧自由基的产生速度，因此会引起伤害[23]。而植物体内的抗氧化酶类如SOD、POD、过氧化氫酶（CAT）等可有效清除氧自由基，在对SOD、POD活性的测定中明显看出，在低浓度时，SOD、POD含量升高，高浓度时，含量均有所下降，说明长时间、高浓度的叠氮化钠诱变使苦荞麦抗氧化系统受到抑制，SOD、POD的活性受到损伤，而低浓度叠氮化钠诱变使植物体内抗氧化系统被激活，因此呈现出上升趋势，在叠氮化钠浓度为0.6 mmol/L时SOD活性达到最大值，在叠氮化钠浓度为0.8 mmol/L时POD活性达到最大值。

参考文献：

[1]孙博航，吴雅清，高慧媛，等. 苦荞麦的化学成分[J]. 沈阳药科大学学报，2008，25（7）：541-543.

[2]牛保山. 浅谈苦荞麦的栽培技术及其开发利用[J]. 科技情报开发与经济，2011，21（12）：145-147.

[3]刘 萍，张东送，吴雅静. 我国苦荞麦的开发利用及存在的问题与对策[J]. 食品科学，2004，25（11）：361-363.

[4]朱云辉，郭元新. 我国苦荞资源的开发利用研究进展[J]. 食品工业科技，2014，35（24）：360-365.

[5]田秀红，刘鑫峰，闫 峰，等. 苦荞麦的药理作用与食疗[J]. 农产品加工（学刊），2008（8）：31-33.

[6]俣野敏子，孙小军，徐正进. 世界荞麦研究动向[J]. 世界农业，1992（1）：25-26.

[7]马名川，刘龙龙，张丽君，等. 荞麦育种研究进展[J]. 山西农业科学，2015，43（2）：240-243.

[8]张玉金，叶 俊，张智勇，等. 苦荞育种现状与探讨[J]. 内蒙古农业科技，2008（3）：90-91.

[9]钮力亚，于 亮，付 晶，等. 叠氮化钠在农作物育种中的应用[J]. 河北农业科学，2010，14（12）：52-53，57.

[10]姜振峰，刘志华，李文滨，等. 叠氮化钠对大豆M1的生物学诱变效应[J]. 核农学报，2006，20（3）：208-210.

[11]曹 欣，杨煜峰，钱强华. 叠氮化钠对不同大麦品种的诱变效应[J]. 浙江农业学报，1991，3（3）：143-146.

[12]張超美. 叠氮化钠对小麦的诱变效应[J]. 湖北农学院学报，1994，14（3）：56-60.

[13]温日宇，郭耀东，刘建霞，等. 不同浓度EMS对甜荞种子发芽的影响[J]. 陕西农业科学，2015，42（1）：12-13，21.

[14]李志勇. 细胞工程实验[M]. 北京：高等教育出版社，2010.

[15]姜 莉，李卫华，王维成，等. 不同浓度EMS对甜菜种子诱变致死率的影响[J]. 中国糖料，2013（1）：28-29.

[16]高俊凤. 植物生理学实验指导[M]. 北京：高等教育出版社，2006.

[17]张超美. 叠氮化钠对豌豆诱变效应的初步研究[J]. 湖北农学院学报，1993，13（4）：276-280.

[18]杨国志，张明方，顾掌根，等. NaN3处理条件下西瓜直接再生试验体系研究[J]. 长江蔬菜，2009（6）：11-14.

[19]陆兆新，黄宝才，虞秋成，等. NaN3不同时间处理水稻种子的诱变效应[J]. 江苏农业科学，1992（4）：6-9.

[20]张会灵，张 烨，常作良，等. NaN3对辣椒种子萌发的生理效应[J]. 中国种业，2015（5）：44-47.

[21]张 凯. EMS诱变头花蓼（Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D. Don.）的初步研究[D]. 重庆：西南大学，2014.

[22]卢 银，刘梦洋，王超硕，等. EMS处理对大白菜种子和幼苗活力的影响及M2表型变异分析[J]. 植物遗传资源学报，2015，16（2）：349-358.

[23]宇克莉，邹 婧，邹金华. 镉胁迫对玉米幼苗抗氧化酶系统及矿质元素吸收的影响[J]. 农业环境科学学报，2010，29（6）：1050-1056.