电穿孔脉冲发生器综述

王云光 邵欢欢 单纯玉

摘  要： 电穿孔是脂质膜在强电场作用下发生的一种现象，它是许多生物医学技术的基础。将电穿孔信号的参数通过优化施加到特定的细胞、组织，以达到电穿孔的目的。电穿孔器是一种改变细胞膜通透性的脉冲发生器。在电穿孔的应用中，我们通常控制和调整电穿孔脉冲发生器电场参数，以适应特定的细胞参数和生物技术或生物医学的应用，即电穿孔的目标。电穿孔脉冲发生器的设计一直受到生物医学应用的驱动。

关键词： 电穿孔; 电穿孔器; 脉冲发生器; 电场

中图分类号：TP301          文献标志码：A      文章编号：1006-8228（2019）05-23-04

Abstract： Electroporation， a phenomenon of lipid membrane under strong electric field， is the basis of many biomedical technologies. The parameters of electroporation signal are applied to specific cells and tissues to achieve the purpose of electroporation. Electroporator is a pulse generator which changes the permeability of cell membrane. In the application of electroporation， we usually control and adjust the electric field parameters of electroporation pulse generator to adapt to specific cell parameters and the application of biotechnology or biomedicine， that is， the target of electroporation. The design of pulse generators for electroporation is always driven by biomedical applications.

Key words： electroporation; electroporator; pulse generator; electric field

0 引言

电穿孔是膜在足够高的电场作用下发生的一种现象[1-2]。它是利用脉冲发生器所施加的外加电场，产生微秒、纳秒甚至皮秒级电脉冲作用于细胞膜，使细胞膜通透性发生改变，从而形成纳米级的细小孔道的过程。电穿孔的效果取决于许多物理和生物参数。这些参数可以分为电场参数[3-4]和细胞参数，这些参数定义了细胞的状态、细胞的环境和细胞的几何形状[5-6]。在电穿孔的应用中，我们通常控制和调整电场参数，以适应特定的细胞参数和生物技术的应用，即电穿孔的目标。电穿孔分为可逆或不可逆两种。可逆性或不可逆性与细胞存活/死亡有关。可逆电穿孔可进一步应用于大、小分子的引入[7]、细胞的融合和蛋白质的插入[8]。目前，电穿孔技術已广泛应用于生物技术领域。破坏性的应用程序依赖于的不可逆电穿孔技术早在20世纪60年代已提出。在过去十年中得到越来越多的关注，其功效是可观的，尤其是在水处理领域，电渗透提高了化学处理的效果，在食品保藏中电渗透提高了食品的保鲜效果。在某些情况下，电渗透已被证明与巴氏杀菌或组织消融同样有效[9]。基于可逆电穿孔技术的应用目前应用更为广泛，并在不同的实验和临床方案中得到证明，其中比较成熟的两项应用是电化学[10]和基因转染[11]。用于电穿孔研究的电穿孔脉冲振幅从mV到kV，频率从Hz到MHz [12]。因此，在设计电穿孔脉冲发生器之前，重要的是要知道脉冲发生器将用于什么应用。例如，对于某些应用，一个非常简单的电穿孔器就足够了。然而，基因转染和细胞电融合则需要辅助信号，如电泳信号和介电信号;多针电极需要电极换向器;细胞器的电穿孔需要非常短的脉冲，临床应用要求符合安全标准。单细胞电穿孔或平面脂质双层电穿孔需要低压电穿孔脉冲[13]。细胞的体外和体内电穿孔需要高压脉冲。然而，细胞器、细菌或酵母的电穿孔需要更高的电压。

1 电穿孔脉冲发生器

电穿孔的可重复性和有效性，在很大程度上取决于所施加的电穿孔信号是否可精确地再现。由于电穿孔过程是由脉冲发生器局部电场驱动的，大多数情况下输出电压是可控的。脉冲发生器产生脉冲的特征是脉冲幅度和持续时间、脉冲数量、脉冲重复频率和换向序列。

一个对电穿孔起关键作用的参数是电穿孔脉冲的持续时间。在短1μs的脉冲中，脉冲的上升时间通常短于源和负载之间的电长度。因此，负载阻抗与脉冲发生器阻抗匹配是非常重要的，这样就不会产生强烈的脉冲反射，从而导致脉冲的延长。然而，对于脉冲超过1μs的，更重要的是要考虑负载阻抗在脉冲或采样过程中发生变化，并且负载传导没有预先定义。另一个需要考虑的重要参数是脉冲形状。对于非常高的电压脉冲，由于高压开关的工作是离散的，只能使用指数脉冲和方波脉冲。如果器件产生指数衰减脉冲，则时间常数和充电时间作为参数。如果设备产生方波脉冲，则给出脉冲长度和脉冲重复频率作为参数。然而，对于较低的电压，可以产生任意脉冲，因为这些电压下的开关也可以线性运行[14]。现就目前电穿孔应用中常用的两种脉冲发生器，做一下阐述。

1.1 电容放电脉冲发生器

这是最早的电脉冲产生的概念，主要用于体外，但有时也用在体内[15]。它产生的是指数衰减脉冲。它包括可变高压电源（V）、电容器（C）、开关（S）和可选电阻（R）（图1）。脉冲发生器工作在两个阶段，充电和放电，并产生指数衰减脉冲。充电阶段，开关（S）位于1位，可变高压电源（V）将电容器（C）充电至预设电压。在放电阶段，开关位于位置2，电容器通过连接到输出端的负载放电。可以近似的放电时间常数τ等于ZLC，C是电容器的电容，|ZL|是负载阻抗的绝对值。然而，脉冲传递过程中生物负载阻抗降低[16]。这也意味着在脉冲过程中时间是恒定的。因此，大多数商用的基于电容器放电的电穿孔器都有与负载并联的内置电阻。其主要目的是为了更好地定义放电时间常数。也就是说，如果附加电阻与负载并联，则放电时间常数由（R||ZL）C定义，其中R为内部电阻。

一个Marx发生器（图2），常用来产生无级衰减脉冲[17]。然而，电容器（C）通过电阻（R）并联充电，然后，通过同时接通所有开关（S）通过负载（ZL）串联放电。最大电压负载ZL=VN，时间常数τ=|ZL| C/N（V为电源电压，N为电容器数目）。

1.2 方波脉冲发生器

方脉冲发生器几乎用于所有电穿孔的应用，不仅因为它简单、经济，而且它能够很好地控制和再现有关的电气参数。方波脉冲发生器与电容放电脉冲发生器非常相似，不同之处在于电压电源（V）不断给电容器（C）充电，而电源开关（S）能够快速开关（图3）[18]。通常采用快功率金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFET）或绝缘栅双极晶体管（IGBT）作为开关。负载必须调整到脉冲形成网络阻抗，以避免可变振幅传递到负载和脉冲反射。脉冲输出幅值由可变电源的幅值确定，脉冲持续时间、脉冲重复频率、可能的脉冲数由快速电源开关的开关频率确定。由于开关速度更快、更复杂，脉冲发生器的控制单元也必须比指数脉冲发生器更快、更复杂。

Blumlein发生器（图4）用于形成纳秒方波脉冲。充电时开关S关闭，高压电源V将输电线路T1和T2充电至预设电压。在放电过程中，开关被打开，传输线通过连接到输出端的负载放电。为了产生没有反射的方形脉冲，ZL必须是Z0的两倍（Z0为传输线阻抗）。

2 电穿孔脉冲发生器研究现状

电穿孔脉冲发生器在工业、医疗等领域具有广泛的应用。传统的电穿孔脉冲发生器，一般采用空气火花开关和 Blumlein 传输线产生脉冲电场。而微秒脉冲作为一种较容易实现的脉冲形式，一般采用电容作为储能器件，由空气火花开关直接放电产生脉宽为微秒级别的脉冲，如1.1节所述。但是由于空气火花开关不能够自行关断，从而使得产生的脉冲一般为指数型式的衰减波。此外，输出波形重复性欠佳，可控性差，寿命短，受负载影响大[19]，因此，很难适用于生物医学领域的研究。

近年来，随着电力电子技术的不断发展，IGBT、MOSFET及可关断晶闸管等固态器件得到广泛的应用[20]。这些固态器件具有体积小、效率高、使用寿命长、工作重复频率高、成本低、工作稳定和维护简单等优势[21]，在脉冲功率领域逐渐得到研究学者的关注。固态开关的功率容量与开关速度关系如图5所示。由图5可以看出，固态开关的工作速度与开关功率之间存在一定的矛盾关系[22]，因此在电穿孔脉冲发生器领域中，一般使用多个开关进行串并联或经过一定的拓扑结构转换以实现高压大功率微秒脉冲输出。对此，研究者也从未停止对电穿孔脉冲发生器的研究步伐。他们利用现代先进的电力电子器件，积极投入电穿孔脉冲发生器的研制，以达到对电穿孔脉冲发生器参数的优化。

Cronje.Thomas F等[23]采用一种级联多电平逆变器拓扑结构的射频MOSFET的高压、高频、双极性脉冲发生器的设计，此设计，在80Ω电阻并联235pf电容的负载情况下，输出脉冲频率高达1MHz，有5级电压输出，输出电压最高可达1.25kV。该脉冲发生器用于电化学治疗和不可逆电穿孔。其脉冲机制是完全可编程的并且由FPGA控制。选择了UCC37321栅极驱动器和HCPL-2400光耦合器。采用阻尼電阻器和RCD缓冲电路来减轻输出电路中的过度振铃。Vitalij Novickij等[24]设计出一种高频亚微妙脉冲发生器。他们利用同步Crowbar开关，实现了大功率方波单脉冲（3kv，60A）的输出，方波脉冲的持续时间为100ns-1ms，预定义重复频率为1Hz到3.5MHz。该电穿孔器成功地灭活了人类病原体白色念珠菌。Mohammad Samizadeh Nikoo[25]等研制了一种dsrd（漂移步进恢复二极管）的两级脉冲发生器结构，在输出端产生较高的峰值功率。从0.3W的平均输入功率中获得1.3kw峰值功率的重复纳秒脉冲。最大输出电压为2.1kV，重复频率为52Hz。上述电穿孔脉冲发生器均为方波脉冲发生器。

综上所述可知，传统电穿孔脉冲发生器由于体积庞大、稳定性低、开关使用寿命短、工作频率低、功率损耗大等原因，只能应用于某些特定的领域。而基于全固态开关器件的电穿孔脉冲发生器工作频率较高，可高达数kHz，甚至MHz，但是输出脉冲电压低。因此可根据现有的固态开关技术及电力电子技术对脉冲发生器进行研制或改进，以实现输出参数的灵活可控，提高脉冲输出电压，并适用于生物医学领域应用。

3 展望

传统的电穿孔技术是由脉冲发生器产生的脉冲驱动的。如今，方波脉冲往往是首选。然而，随着脉冲发生器变得越来越复杂，更复杂的波形是可能的。这些个别化或混合模式波结合了方波、指数波和正弦波信号的元素，为特定的应用产生电穿孔脉冲发生器。未来新的电穿孔脉冲发生器将促进一些灵活性类型的电穿孔脉冲设备的研发。在未来，研究者们将尝试制造越来越短的电穿孔脉冲，并使用特殊的设备将脉冲应用于生物负载。未来，他们利用电穿孔脉冲发生器治疗人体肿瘤，而这一过程中获得一些数据，可能有助于解决电穿孔是如何发生的。最后，新的电子元件将促进脉冲发生器实现更高的电压、电流输出。

4 结束语

电穿孔脉冲发生器的设计一直深受生物医学应用的驱动，同时电穿孔脉冲发生器也得到了学术界和产业界的高度重视和关注。本文对电穿孔脉冲脉冲发生器的设计进行了研究，从电穿孔的应用出发，对电穿孔脉冲发生器机理给出了阐述，对现阶段电穿孔脉冲发生器的发展现状做出了总结，并对未来电穿孔脉冲发生器的发展趋势作出展望。多模态超短脉冲方波电穿孔脉冲发生器将成为未来的研究趋势。

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