移植量、光密度及温度对条斑紫菜不同品系壳孢子放散量的影响

吕峰 严兴洪 王小红 严林俊 张敏 陆德祥

摘要：以条斑紫菜优良品系深丰1号、深丰2号及野生品系WT为试验对象，在条斑紫菜自由丝状体移植育苗过程中设置不同的自由丝状体移植量和光温条件，研究不同生态条件下条斑紫菜不同品系丝状体生长和壳孢子放散量情况。结果表明，贝壳丝状体营养生长阶段，10～50 μmol/（m2·s）范围内提高光密度或15～25 ℃范围内提高温度都能加快贝壳丝状体的营养生长，初始藻落密度提高，丝状体能更快布满贝壳表面，获得更高的藻落密度;条斑紫菜贝壳丝状体培养适宜的移植量、光密度、培养温度分别为100 mg/m2、10 μmol/（m2·s）、20 ℃。

关键词：条斑紫菜;优良品系;自由丝状体;移植;贝壳;壳孢子放散量

中图分类号： S917.3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0186-02

目前，我国大规模养殖的紫菜种类主要为坛紫菜（Porphyra haitanensis Chang et Zheng）和条斑紫菜（Porphyra yezoensis Ueda），其中，坛紫菜是我国特有的品种，其产量约占全国紫菜产量的75%[1]，主要在福建、浙江等南方省份广泛养殖，而条斑紫菜则主要在江苏、山东等2个省份养殖。传统的贝壳丝状体育苗是将成熟叶状体放散的果孢子播撒到贝壳表面，使其钻入贝壳形成贝壳丝状体，成熟的贝壳丝状体释放出壳孢子，并附网萌发长成紫菜叶状体苗。传统的育苗方法设施简单、操作简易，生产技术已基本稳定成熟，易于扩大规模推广，至今仍在世界各国广泛应用[2]。但是，有研究发现，紫菜果孢子也可以不钻入贝壳，在海水中可以直接萌发成自由生活的丝状体，而利用大量繁殖的自由丝状体并培养至壳孢子放散可直接采苗以养成紫菜。目前，各国藻类学者对不同紫菜品种自由丝状体发育过程中主要影响因子和发育调控机制等进行了大量研究，以实现对紫菜自由丝状体发育的精确调控，并完善相应的自由丝状体直接采苗技术，但迄今仍局限于实验室研究或小规模生产性试验，尚未达到大规模生产育苗应用的水平[2-4]。

深丰1号、深丰2号是人工诱变培育出的优质、高产、抗高温条斑紫菜品系，具有耐高温、生长快、产量高、品质好等特性，其大规模养殖可使条斑紫菜的产量和品质有大幅度提升。本试验以深丰1号、深丰2号为材料，研究不同移植量、移植期不同光温条件对贝壳丝状体生长量和壳孢子放散量的影响，以期探索出条斑紫菜优良品系自由丝状体适宜的移植密度和光温条件，并完善自由丝状体移植和培养技术，为条斑紫菜优良品系自由丝状体大规模移植育苗提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

条斑紫菜品系深丰1号、深丰2号，由南通科技职业学院环境与生物工程学院通过人工诱变选育获得，并以自由丝状体保存;条斑紫菜野生型品系WT，由笔者所在实验室2001年从江苏省启东市吕四港镇海区采摘，其分离与保存参照文献[5]中的方法进行。丝状体移植使用的贝壳为文蛤壳，经洗刷和水煮处理，放入长、宽、高分别为20.5、14.0、5.0 cm的长方形塑料盒中，15个贝壳1组。培养液由自然海水加2-（N-吗啉）乙磺酸缓冲液（MES缓冲液）[6]配制而成。

1.2 贝壳丝状体促熟

试验于2016年4月至2017年8月在上海海洋大学藻类育种实验室进行，贝壳丝状体培养至移植后50 d，将贝壳丝状体移至温度为23 ℃、光密度为30 μmol/（m2·s）（8 h光照/16 h黑暗）条件下培养，每7 d更换1次添加1 mg/mL氮、10 mg/mL 磷的灭菌海水，以促进贝壳丝状体的成熟;培养至移植后85 d，将丝状体已成熟的单个贝壳置于200 mL烧杯中，加入50 mL培养液进行冲气培养3～4 d，温度降至（18±1） ℃，以促使壳孢子放散。

1.3 壳孢子放散量计数

當每个视野（10×10）有10个壳孢子左右时，开始统计壳孢子的放散量。将50 mL壳孢子水倒入直径为9 cm的培养皿内，沉淀24 h，在倒置显微镜下计数40个视野（10×10）内的壳孢子数;取单个视野内壳孢子数平均值，根据1个视野的面积和培养皿底面积，计算出1个培养皿内的壳孢子数，即为该贝壳的壳孢子日放散量;连续计数3 d，其总和即为贝壳的总壳孢子放散量。对每组15个贝壳全部计数，取平均值，即为该组单个贝壳的壳孢子放散量。

1.4 不同试验条件对贝壳丝状体生长量和壳孢子放散量的影响

1.4.1 移植量 贝壳丝状体移植量分别为50、100、200、350、500 mg/m2，统计初始藻落密度后转移至温度为18 ℃、光密度为10 μmol/（m2·s）（14 h光照/10 h黑暗）条件下培养，每7 d更换1次培养液，并分别于移植后25、35、45 d拍摄贝壳丝状体生长状况照片;贝壳丝状体促熟，并统计壳孢子放散量。

1.4.2 光密度 贝壳丝状体移植量为100 mg/m2，培养至 14 d，洗去贝壳表面多余的自由丝状体，分别置于光密度为10、30、50 μmol/（m2·s）（14 h光照/10 h黑暗）条件下培养，温度为 18 ℃，每7 d更换1次培养液，并于移植后25、35、45 d 拍照;贝壳丝状体促熟，并统计壳孢子放散量。

1.4.3 温度 贝壳丝状体移植量为100 mg/m2，培养至 14 d，洗去贝壳表面多余的自由丝状体，分别置于温度为15、20、25 ℃条件下培养，光密度为10 μmol/（m2·s）（16 h光照/10 h黑暗），每7 d更换1次培养液，并于移植后25、35、45 d 拍照;贝壳丝状体促熟，并统计壳孢子放散量。

1.5 统计分析

采用Excel 2010软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同移植量对贝壳丝状体生长和壳孢子放散量的影响

试验结果表明，随着初始藻落密度的提高，贝壳丝状体能更快布满贝壳表面，在相同时间内形成更密的藻丝层。由图1可知，随移植量的增加，深丰1号、深丰2号、WT这3个品系的壳孢子放散量均呈先增后减的趋势，以移植量为 100 mg/m2 时壳孢子放散量相对最多;对不同移植量而言，除深丰2号在贝壳丝状体移植量为200 mg/m2时壳孢子放散量相对最多外，其他移植量均以WT的壳孢子放散量相对最多。

2.2 不同光密度对贝壳丝状体生长和壳孢子放散量的影响

试验结果表明，随着光密度增加，贝壳丝状体生长明显加快，与低光密度下培养的贝壳丝状体相比，贝壳丝状体在较高的光密度下能更快布满贝壳表面，藻落密度相对更大。由图2 可知，当移植量为100 mg/m2、光密度在10～50 μmol/（m2·s） 范围内时，随着光密度增加，各贝壳丝状体壳孢子放散量呈降低趋势;在不同光密度条件下，WT的壳孢子放散量相对最多。

2.3 不同温度对贝壳丝状体生长和壳孢子放散量的影响

试验结果表明，培养温度提高能明显加快贝壳丝状体的生长，在较高温度条件下，贝壳丝状体能更快布满贝壳表面，藻落密度大于低温条件下培养的贝壳丝状体。由图3可知，当移植量为100 mg/m2、培养温度在15～25 ℃范围内时，随着培养温度的升高，各贝壳丝状体壳孢子放散量呈先增后减的趋势，20 ℃时贝壳丝状体壳孢子的放散量相对最多;培养温度为15、25 ℃条件下，WT的壳孢子放散量相对最多。

3 结论与讨论

在生产上应用自由丝状体技术，既可缩短丝状体的培养周期，又可有效控制丝状体在贝壳上的密度而得到健全的壳孢子，减少丝状体培育过程中病害的发生[7]。目前，自由丝状体技术作为条斑紫菜育种、选种的重要手段在日本得到广泛应用。马家海等研究认为，利用条斑紫菜自由丝状体进行移植育苗，适宜的移植密度非常重要[7]。本试验结果表明，贝壳丝状体移植量在50～500 mg/m2范围内，提高自由丝状体移植量可以大幅度增加钻入贝壳的初始藻落密度，增加贝壳内的丝状体生物量，但是，当移植量超过100 mg/m2，贝壳丝状体放散的壳孢子量反而减少，其原因可能是当贝壳内初始藻落密度超过一定限度，雖然贝壳内藻丝大量生长，但藻丝间相互过分重叠，导致中下层的藻丝对光照、营养的需求得不到满足，从而影响膨大藻丝的形成或膨大藻丝细胞无法同步发育成熟，影响了壳孢子的集中放散。因此，自由丝状体移植育苗时，合适的移植量对培育合理密度的贝壳丝状体、促进壳孢子集中大量放散有重要影响，过高、过低的移植量均会降低贝壳丝状体壳孢子的放散量。

紫菜丝状体的光补偿点很低，贝壳丝状体在自然环境低光密度条件下能生存，在更深的海底也有分布[8]，但是，光密度低于10 μmol/（m2·s）时，贝壳丝状体生长过于缓慢，而直射光超过60 μmol/（m2·s）可引起丝状体死亡。本试验结果表明，10～50 μmol/（m2·s）光密度条件下培养的贝壳丝状体能正常生长，并放散壳孢子，且提高光密度对贝壳丝状体生长有明显的促进作用;当光密度为10 μmol/（m2·s）时，深丰1号、深丰2号、WT这3个品系的壳孢子放散量相对最多，随着光密度的增加，贝壳丝状体壳孢子放散量逐渐下降。因此，在10～50 μmol/（m2·s） 范围内适当调整光密度，是调控贝壳丝状体生长以获得适当贝壳丝状体密度的有效方法。

本试验结果表明，培养温度在15～25 ℃时，贝壳丝状体的生长随温度的升高而明显加快，但20 ℃时贝壳丝状体壳孢子的放散量却相对最多，这是由于15 ℃时贝壳丝状体生长较为缓慢，在相同培养时间条件下，导致获得的贝壳丝状体密度过低，总量相对较少，造成壳孢子放散量相对较少，而25 ℃时贝壳丝状体生长过快，藻丝过于密集，贝壳丝状体不能同步成熟，壳孢子也不能大量集中放散。因此，20 ℃是培养贝壳丝状体较为适宜的温度。

参考文献：

[1]严兴洪，李 琳，有贺祐胜. 坛紫菜减数分裂位置的杂交试验分析[J]. 水产学报，2006，30（1）：1-7.

[2]何培民，秦 松，严小军，等. 海藻生物技术及其应用[M]. 北京：化学工业出版社，2007：99-105.

[3]王素平，姜红如. 条斑紫菜游离丝状体生态的研究[J]. 海洋水产研究，1983（5）：1-5.

[4]汤晓荣，费修绠. 光温与坛紫菜自由丝状体生长发育的关系[J]. 海洋与湖沼，1997，28（5）：475-482.

[5]Kato M，Aruga Y. Comparative studies on the growth and photosynthesis of the pigmentation mutants of Porphyra yezoensis in laboratory culture[J]. Japan Journal of Phyco1ogy，1984，32：334-347.

[6]王素娟，张小平，徐志东，等. 坛紫菜营养细胞和原生质体培养的研究Ⅰ[J]. 海洋与湖沼，1986，17（3）：217-221，271-272.

[7]马家海，蔡守清. 条斑紫菜的栽培与加工[M]. 北京：科学出版社，1996：77-84.

[8]陈昌生，纪德华，王秋红，等. 坛紫菜丝状体种质保存技术的研究[J]. 水产学报，2005，29（6）：745-750.