ADAM12在原发性肝癌侵袭性中的作用及机制研究

张杨，杨琰，张翌，曹钧

(1.中国人民解放军中部战区总医院普通外科，湖北 武汉430070；2.湖北省妇幼保健院儿童血液科，湖北 武汉430070)

如何抑制肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的复发一直是国内外研究的热点[1]。目前已证实上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一种重要的肿瘤侵袭转移机制，是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质细胞表型的生物学过程。研究表明，HCC可经EMT获得间质细胞特性，增强侵袭能力，发生远处转移[2]。因此，如何通过调控肝瘤细胞EMT抑制其侵袭近年来逐渐受到大家关注。

ADAM家族即去整合素-金属蛋白酶家族，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，其作用是参与调节细胞之间和细胞与基质间的相互作用。有学者在中枢神经肿瘤中的研究表明，ADAM12可以通过调节E-cadherin促进肿瘤细胞侵袭[3]。另外，ADAM12可以参与膜铆钉蛋白活性功能区的释放，如肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)，从而调控细胞的增殖。Le Pabic等[4]于2003年首次证实ADAM12在肝癌组织中有表达，并且已证实与HCC的侵袭相关。但是，目前ADAM12与HCC侵袭转移的具体作用及其机制尚不明确，尤其是ADAM12是否通过调控HCC的EMT来调节其侵袭尚缺乏相关研究。本研究拟通过临床资料统计分析与细胞实验，探讨ADAM12与HCC肿瘤病理的关系，及其调控肝癌增殖、侵袭的具体机制。

资料与方法

一、病例与随访

2014年1月至2016年1月在本中心因原发性肝细胞癌行手术治疗的病例69例，收集病人的性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期等信息，并随访至2017年12月31日。

二、免疫组织化学检测

病理组织标本包埋切片，脱蜡，高温修复抗原，3%H2O210 min，10%山羊血清室温封闭1 h；Ki67、ADAM12多克隆兔抗(proteintech，USA)4 ℃孵育过夜。用抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(proteintech，USA)检测Ki67、ADAM12抗体结合情况并显色。苏木素复染，脱水处理，中性树脂封片。Ki67染色结果由两位病理科医生根据肝癌细胞阳性率进行评分：≤50%评判为Ki67低；>50%评判为Ki67高。ADAM12染色结果由两位病理科医生根据肝癌细胞阳性率进行评分：“+”(1%～24%)，“++”(25%～49%)，“+++”(50%～74%)，“++++”(75%～100%)。

三、细胞培养

用含10%胎牛血清(life science，USA)和1%双抗的DMEM(gibeco，USA)，于5% CO2的37 ℃孵箱中培养，培养HepG2、MHCC97H肝癌细胞系(细胞系均由中国人民解放军中部战区总医院肝胆外科实验室提供)。

四、慢病毒感染

构建ADAM12干扰LV10-ADAM12(human)和过表达LV8-ADAM12(human)慢病毒(吉凯基因，中国)。感染内接种适量细胞，感染时细胞融合度为50%～70%。感染时，更换新鲜培养基，每孔加1 ml培养基，并加入10 μl的慢病毒(病毒滴度：1×109TU/ml)。72 h后在荧光显微镜下观察细胞感染率，并用Western Blot检测ADAM12的表达改变。

五、细胞增殖实验

在96孔板中每孔接种1×103个细胞，每组设置3个复孔。将细胞刚好贴壁记为0 h，于24 h利用Cell Counting Kit-8(CCK-8；碧云天，China)检测细胞增殖；每孔加入10 μl CCK-8，在细胞培养箱中孵育1 h，然后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(A值)。

六、侵袭实验

Transwell小室(Millipore，USA)底部铺入50 μl Basement Membrane Matrix(Corning，USA，稀释=1∶2)，细胞孵箱中2 h。收获细胞，制成每200 μl DMEM(GIBECO，USA)中含6×104个细胞悬液。Transwell上室加入200 μl DMEM细胞悬液，下室加入800 μl含10%胎牛血清DMEM，细胞培养箱中侵袭48 h后取出，多聚甲醛中固定，结晶紫中染色，PBS洗净，并用棉签轻轻擦拭Transwell小室上室底部。晾干后，将小室倒置于显微镜下观察并拍照，计算细胞数目。

七、Western Blot

于6孔板种植细胞，待细胞贴壁，融合度达到70%～90%时，加入RIPA裂解液(每孔加入150 μl RIPA)，提取细胞蛋白；取组织标本10 mg，加入RIPA裂解液(严格按照说明书)，提取组织蛋白；BCA法测定蛋白浓度。Western Blot具体步骤如前所述[5]，一抗(GAPDH，1∶1 000；ADAM12，1∶1 000；E-cadherin，1∶1 000；N-cadherin，1∶1 000；Vimentin，1∶1 000；均购自Proteintech Group，USA)，二抗(羊抗小鼠，1∶2 000；羊抗兔，1∶2 000，Proteintech Group)，ECL反应，曝光机采集信号，GeneTools分析A值，目标蛋白A值与内参照GAPDHA值的比值为相对表达量。

八、统计方法

结 果

一、临床资料分析

本研究共收集了69例原发性肝癌病例，病理诊断确诊为HCC，年龄为(57.7±12.4)岁，男性53例(76.81%)。肿瘤大小为(5.7±3.5) cm，范围为0.4～11.3 cm。肝癌TNM分期、WHO肝细胞癌组织分化程度见表1。

二、ADAM12表达与HCC病理之间的关系

对69例原发性肝细胞癌病人的癌组织样本进行ADAM12免疫组织化学染色，根据ADAM12染色密度进行评分。其中，评分为0的14例(20.29%)，8例(11.59%)为“+”，17例(24.64%)“++”，20例(28.99%)“+++”，10例(14.49%)“++++”。将评分为0和“+”的免疫组织化学结果定义为低表达，“++”～“++++”定义为高表达(图1)。结果表明，TNM分期越高，肿瘤分化程度越低，Ki67指数越高，ADAM12高表达的比例越大，差异有统计学意义(P<0.05)(表1，图2)。

表1 ADAM12表达与HCC临床病理之间的关系(例)

三、ADAM12表达与预后之间的关系

术后3年ADAM12低表达组病人复发9例(40.91%)，而ADAM12高表达组病人复发34例(72.34%)，差异有统计学意义(2=6.305；P=0.012)，提示ADAM12高表达组肿瘤复发率明显升高。

四、ADAM12对肝癌细胞增殖、侵袭的影响

结果发现在HepG2肝癌细胞系中，抑制ADAM12的表达抑制了细胞增殖，而过表达ADAM12促进了细胞增殖，且差异有统计学意义(对照组：1.03±0.51；ADAM12沉默组：0.74±0.33；ADAM12过表达组：1.75±0.62；F=5.38，P=0.021)。在MHCC97H肝癌细胞系中亦发现了相似的结果(对照组：1.12±0.36；ADAM12沉默组：0.47±0.24；ADAM12过表达组：1.83±0.56；F=13.86，P=0.000)。上述结果表明，ADAM12促进了肝癌细胞增殖；抑制ADAM12，可以抑制肝癌细胞增殖。

同时，结果发现抑制ADAM12表达后，HepG2细胞穿膜细胞数明显少于对照组，而过表达ADAM12组，HepG2细胞穿膜细胞数明显多于对照组[对照组(144.0±22.8)个，ADAM12沉默组(97.0±25.1)个，ADAM12过表达组(193.0±22.4)个，F=20.93，P=0.000]。在MHCC97H细胞系中亦发现了相似的结果[对照组(127.0±21.6)个，ADAM12沉默组(95.0±22.0)个，ADAM12过表达组(175.0±23.7)个，F=16.08，P=0.000](图3)。上述实验结果表明，ADAM12促进了肝癌细胞侵袭；抑制ADAM12，可以减弱肝癌细胞侵袭。

五、ADAM12对肝癌细胞EMT的调控作用

在HepG2细胞系中，ADAM12沉默组，上皮标志物E-cadherin的表达明显高于对照组，而间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达则低于对照组；反之，ADAM12过表达组，E-cadherin的表达低于对照组，而N-cadherin和Vimentin的表达则明显高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)(图4)。在MHCC97H细胞系中，亦发现了相似的结果(图4)。该结果提示，ADAM12促进肝癌细胞EMT，增强了癌细胞间质化。

讨 论

肝癌细胞的高侵袭能力是原发性肝癌预后差、死亡率高的重要原因之一。近年来，防治肝癌侵袭对改善病人预后的意义逐渐被多数学者认可，因此，探讨肝癌侵袭的机制是近年来研究热点[6]。研究表明，肝癌细胞EMT过程是其获得侵袭能力的关键，同时，EMT还影响到肝癌细胞的增殖与血管构建。目前认为，肝癌细胞经EMT获得间质细胞特性，侵袭能力增强。在恶性肿瘤中，EMT的相关机制与信号通路研究已较深入，其中ERK在EMT中发挥的关键作用亦被多数学者认可[7]。ADAM12作为ADAM家族的重要成员，在多种恶性肿瘤中的作用已得到广泛研究。但是关于ADAM12在HCC中的作用的研究却相对匮乏。我们的研究表明，ADAM12通过影响细胞蛋白骨架，尤其是间质标志物(N-cadherin、Vimentin)表达，促进肝癌细胞间质化，影响肝癌细胞增殖、侵袭能力[5，8]。通过抑制ADAM12，可以降低肝癌细胞增殖与侵袭。

ADAM12是去整合素-金属蛋白酶家族一员，可通过多种机制调控肿瘤侵袭。ADAM12胞外段的金属蛋白酶区可通过降解细胞外基质促进肿瘤细胞侵袭；ADAM12可以作用于IGFBP-3的底物，导致IGFBP-3水平下降，导致p53诱导的细胞凋亡下降；ADAM12还可水解HB-EGF，导致其释放活性外功能区(sHB-EGF)。sHB-EGF具有较强的致瘤能力和生血管效应，能够通过激活基质金属蛋白酶(MMPs)增强细胞侵袭能力，还能够作为表皮生长因子(EGFR)最主要的配体，促肿瘤细胞增殖[9-11]。由此可见，ADAM12可以通过多种机制调控肝癌的增殖与侵袭。

图1 肝癌组织中ADAM12免疫组织化学染色 A.分期Ⅰ期病人标本染色，ADAM12低表达，评分“+”；B.分期Ⅳ期病人标本染色，ADAM12高表达，评分“++++” 图2 肝癌组织中ADAM12检测 不同TNM分期ADAM12表达差异明显，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人ADAM12表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期 图3 沉默或过表达ADAM12后，HepG2、MHCC97H肝癌细胞侵袭能力改变 图4 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin在HepG2、MHCC97H肝癌细胞系中表达变化

Le Pabic等于2003年首次证实ADAM12在肝癌组织中有表达，其他研究亦证实，ADAM12在HCC中表达丰度明显高于ADAM8、ADAM9等其他ADAMs家族成员[4，12]。因此，我们推测ADAM12与HCC侵袭相关性可能更大。研究表明，ADAM12表达越高，肝癌分化程度越低，分期晚，肿瘤越大，预后越差。通过探究ADAM12影响肝癌侵袭的机制发现，ADAM12可通过调控肌动蛋白骨架调控EMT。由于EMT的实质是细胞骨架重塑，其中肌动蛋白丝动态装配对维持细胞运动功能具有重要作用。而ADAM12可调控p53信号系统，进一步调节核转录因子NF-κB，调控EMT。通过检测EMT标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin发现[13-14]，ADAM12表达下调可诱发上皮标志物(E-cadherin)表达上调，而间质标志物(N-cadherin、Vimentin)表达下调；ADAM12表达上调时，间质标志物表达明显上调，但上皮标志物表达下调。这提示ADAM12可以促进肝癌细胞间质化，增强细胞运动能力。虽然本研究中初步探讨了ADAM12对肝癌细胞EMT的调控作用，但是ADAM12调控EMT的具体机制未深入探讨。ADAM12是通过增加p53活化影响EMT，还是直接作用于细胞骨架影响EMT仍待进一步探讨，这亦是本课题进一步的研究方向。

ADAM12通过调控肝癌细胞EMT，促进肝癌细胞增殖、侵袭。通过抑制ADAM12，可降低肝癌细胞增殖、侵袭能力，这可能为临床上治疗HCC提供新的思路。