长期不同磷肥施用量对砂姜黑土真菌多样性、群落组成和种间关系的影响

马 垒,赵文慧,郭志彬,王道中,赵炳梓

1 中国科学院南京土壤研究所,土壤与农业可持续发展国家重点实验室,南京 210008 2 安徽省农业科学院土壤肥料研究所,合肥 230031 3 中国科学院大学,北京 100049

砂姜黑土广泛分布于安徽、河南,山东等省,是我国主要的中低产田之一,其中磷有效性不足是砂姜黑土作物生产的重要限制因素[1-2]。施用化学磷肥是提高磷素有效性,提升作物产量的最主要的农业措施之一[3],但同时也可能影响地下微生物[4]。我们之前的研究表明,长期施用磷肥可显著提高砂姜黑土酶活性和细菌多样性,同时改变细菌群落结构[5]。然而长期施用磷肥对砂姜黑土真菌群落的影响目前仍不清楚。

真菌是农田土壤中最常见的微生物之一,根据营养方式可将其划分为腐生营养型、共生营养型和病原型等三种类型,在土壤有机质转化、促进/抑制作物生长和控制作物疾病等方面具有重要作用[6]。真菌的生长受温度、pH、水分和养分等多种土壤环境因子的影响[6]。磷肥的施用一方面可通过增加磷素有效性直接影响真菌群落结构,同时还可以通过改变土壤pH、碳氮有效性以及影响植物生长等间接影响真菌群落结构[4,7-8]。Beauregard等[4]对单一苜蓿耕作的壤质粘土进行8年不同磷肥施用梯度(不施磷肥、P2O520 kg/hm2和P2O540 kg/hm2)处理后,发现真菌群落结构发生显著变化,但并未对真菌多样性和丛枝菌根真菌群落结构产生明显影响。而Cheng 等[9]发现经过90年长期施用磷肥(P2O5100 kg/hm2)后丛枝菌根真菌多样性显著降低,并且形成了一个与未施磷处理明显不同的群落结构。这种不一致的结果可能是由于不同的磷肥施用量、土壤质地或作物轮作方式导致。虽然关于长期施用磷肥对真菌影响已有一些研究,但这些研究或者利用低分辨率的方法(比如DGGE,PLFA等)[4,10],或者没有设置不同的磷肥梯度来研究不同磷肥施用量对真菌群落的影响[9]；且多数研究集中在施磷对真菌多样性、群落组成的影响[4,7-11],而长期不同磷肥施用量下真菌网络构成和物种间的关系仍不清楚。

本研究以安徽蒙城砂姜黑土氮磷钾肥肥效长期定位试验为平台,选取P0(不施磷肥)、P1(P2O545 kg/hm2)和P2(P2O590 kg/hm2)3个磷肥施用梯度。利用现代高通量测序技术,测定经过21年长期施用磷肥后真菌群落多样性及群落组成的差异。同时利用新兴的网络分析手段,研究不同磷肥施用量下真菌网络关系,探索磷肥施用对真菌种间关系的影响。

1 材料与方法

1.1 长期试验样地概况

长期试验位于农业部蒙城砂姜黑土生态环境站内(33°13′N,116°35′E)。该试验站地处皖北平原,属于暖温带半湿润季风气候,年平均降雨量872.4 mm,年均气温14.8℃,供试土壤为砂姜黑土区最具代表的普通砂姜黑土。试验开始(1994年)前土壤基本理化性质如下：有机质9.90 g/kg,全氮0.79 g/kg,全磷0.28 g/kg,有效磷7.80 mg/kg,速效钾111.00 mg/kg。试验样地1994—1998年为小麦玉米轮作,1998—2015年为小麦大豆轮作。

1.2 长期试验样地设计

试验共设置9个处理,本研究选取其中3个处理,即：(1)P0(不施磷肥)；(2)P1(P2O545 kg/hm2)；(3)P2(P2O590 kg/hm2)。每个处理设置3个重复,小区面积19 m2,完全随机区组设计。除磷肥施用差异外,所有处理氮肥和钾肥施用量一致,其中N 187.5 kg/hm2,K2O 135 kg/hm2。氮肥为尿素,磷肥为普钙,钾肥为氯化钾。小麦、大豆品种为当地主栽品种,每5—10年更换一次。

1.3 土壤样品采集

所有土壤样品于2015年6月小麦成熟期时采集,即截止样品采集时,各处理已经历总共21年不同施肥处理。采用S采样法,使用直径5 cm的土钻采集0—15 cm的表层土壤,每个小区采取9钻混合成一个土壤样品。所有样品采用冰袋保鲜运回实验室。土壤样品在去除植物根系和大的石块后过2 mm筛混匀。所有样品分为两部分,一部分室温下风干后用于土壤理化性质测定,另一部分置于-80℃用于土壤DNA提取。

1.4 土壤理化性质测定

1.5 土壤DNA提取及真菌ITS1基因高通量测序

土壤DNA采用Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)试剂盒提取。每个样品称取0.50 g鲜土,按照说明书操作提取DNA。

选取真菌ITS1区进行高通量测序。PCR扩增采用特异性引物ITS5F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)/ITS1R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。每个样品前端引物均含有不同的7 bp Barcode用于区分不同样品。PCR扩增条件包括94℃ 5 min；90℃ 60 s,55℃ 60 s,72℃ 75 s,30个循环,之后72℃ 10 min。反应产物采用QIA quick PCR Purification kit(Qiagen)进行纯化。将不同样品的 PCR 扩增产物等摩尔混合后,采用Illumina公司MiSeq测序仪完成序列分析(委托上海派森诺生物科技股份有限公司测定)。

1.6 数据统计分析

高通量测序所得序列按照以下步骤进行分析[5]：(1)双端序列采用FLASH进行拼接；(2)使用Cutadapt切除引物；(3)采用QIIME(1.91)去除质量分数低于20,序列短于200 bp的低质量序列；(4)采用RDP数据库去除嵌合体；(5)得到的高质量序列采用Uparse软件,以97%相似度进行OTU划分,采用Blast方法以UNITE数据库为比对进行注释。将未注释到门水平序列删除后,所有样品随机抽取27,000条序列进行后续分析。真菌香农指数在QIIME中计算。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)、冗余分析(RDA)均使用R 2.15.3软件的vegan包进行。使用vegan包中的“mrpp”、“anosim”和“adonis”函数进行真菌群落结构相似性检验,使用“bioenv”函数得到最优的RDA模型。Linear Discriminant analysis(LEfSe)在Galaxy网站(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)中进行,其中LDA值大于3的物种为显著差异物种。采用SparCC 软件进行网络分析,为了减少网络复杂度,只选取SparCC 值|r|>0.80,P<0.001的关系用于网络构建。网络参数的计算和网络图形制作在Gephi 0.9.2软件中进行。使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析和相关分析,采用新复检验法(Duncan′s New Multiple Range Test)进行平均值显著性多重比较(P<0.05)。采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.0软件进行数据处理和绘图。

2 结果

2.1 土壤理化性质

土壤理化性质如表1所示。长期不同磷肥施用量对土壤pH和全氮均没有显著影响(P>0.05,下同),但土壤有机碳在P2处理中显著升高(P<0.05,下同),分别比P0和P1处理提高7.65%和10.33%。全磷和可溶性有机碳含量均随着磷肥施入量的增加而显著升高,其中P2和P1处理全磷分别比P0处理增加40.00%和24.00%,可溶性有机碳分别增加31.36%和15.60%。铵态氮和硝态氮在不同施肥处理中呈相反的变化趋势,其中铵态氮按照P0

表1 长期不同磷肥施用量对砂姜黑土理化性质的影响Table 1 Physico-chemical properties of the lime concretion black soil relative to long-term P fertilization

2.2 真菌群落多样性

经过质量控制后,总共得到423426条高质量序列(每个样品27137—64626条序列),所有样品均一化为27000条序列后,以97%相似度与UNITE数据库进行比对,总共得到321个OTU(每个样品237—263个OTU),这些OTU归属于10个门,29个纲,66个目,107个科和147个属。以香农指数表征真菌α-多样性(图1),发现当序列数达到27,000条时,香农指数在P0处理中最高(5.43),P1处理居中(5.10),而P2处理最低(4.99),但各处理间差异未达显著性水平。相关性分析表明(图1),香农指数与土壤中全磷(r=-0.678,P=0.045)和有效磷(r=-0.677,P=0.045)均成显著负相关。以上结果表明随着磷肥施入量的增加,土壤全磷和有效磷含量随之升高,而真菌α-多样性有不断降低的趋势。

图1 长期不同磷肥施用量对砂姜黑土真菌群落α多样性的影响及其与全磷和有效磷之间的关系Fig.1 Fungal alpha-diversity of the lime concretion black soil relative to long-term P fertilizationP0：不施肥对照,unamended control；P1：施用P2O5 45 kg/hm2,chemical P fertilizer was applied at P2O5 45 kg/hm2；P2：施用P2O5 90 kg/hm2,chemical P fertilizer was applied at P2O5 90 kg/hm2；AP：available phosphorus；TP：total phosphorus

对均一化的OTU表,基于Bray-Curtis距离进行主坐标分析(图2)发现,主坐标的前两轴总共解释了63.63%的总方差,其中第一轴和第二轴分别解释46.17%和17.46%的总方差。不施用磷肥的P0处理聚集在左侧,而施用磷肥的P1和P2处理聚集在右侧。分别采用MRPP、ANOSIM和ADONIS的方法对不施磷肥的P0处理与施用磷肥的P1和P2处理真菌群落进行相似性检验,结果发现真菌群落结构在施用磷肥后发生显著变化。以不同处理中OTU丰度作为响应变量,以土壤理化性质作为解释变量进行冗余分析,结果发现DOC和TP是导致施磷后真菌群落结构变化的主要环境因子。以上结果表明长期施用磷肥后真菌群落结构发生显著改变,这种变化与土壤养分(TP和DOC)密切相关。

图2 长期不同磷肥施用量下砂姜黑土真菌群落结构及其与土壤理化因子关系Fig.2 Fungal community structure and its relationship with soil properties of the lime concretion black soil relative to long-term P fertilizationMRPP：多响应置换过程分析,multiple response permutation procedure；ANOSIM：相似性分析,analysis of similarities；ADONIS：多元方差分析,analysis of variance using distance matrices；TP：全磷,total phosphorus；DOC：可溶性有机碳,dissolved organic carbon

图3 长期不同磷肥施用量下砂姜黑土真菌群落相对丰度大于1%的门、纲以及属水平上差异物种Fig.3 Relative abundance of the most abundant phyla,class and the influential species at genus level relative to long-term P fertilization柱子高度和误差线代表平均值和标准差(n=3),不同字母表示在不同处理间显著差异(Duncan 法,P<0.05),条形图长度代表LDA值,只显示不同组间差异显著的物种(LDA>3)

2.3 真菌群落组成

子囊菌门(Ascomycota)是砂姜黑土中的优势菌(图3),其相对丰度在9个样品中在65.71%—79.86%之间。其余相对丰度大于1%的门主要为被孢霉菌门(Mortierellomycota)和担子菌门(Basidiomycota),其在3个处理中平均相对丰度分别为9.54%和2.12%。单因素方差分析发现不同真菌物种对磷肥施用响应不同(图3)。在门水平上(图3),子囊菌门相对丰度随磷肥施入而显著增加,P2和P1处理分别比P0高出9.87%和11.75%；而被孢霉菌门则随磷肥施入而显著降低,P2和P1分别比P0降低42.63%和43.81%；其余菌门在3处理间差异未达到显著水平。

在纲水平上(图3),子囊菌纲(Sordariomycetes)相对丰度最高,在3个处理中平均相对丰度占总序列数的45.31%。其余相对丰度大于1%的分别为散囊菌纲(Eurotiomycetes)、被孢霉菌纲(Mortierellomycetes)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)和座囊菌纲(Dothideomycetes)。单因素方差分析发现子囊菌纲相对丰度随磷肥施入而显著升高,P1和P2处理分别比P0提高15.97%和28.63%；尽管被孢霉菌纲相对丰度在P1和P2处理间没有显著差异,但它们比P0处理分别降低了42.63%和43.82%；对锤舌菌纲来说,只有P2处理显著降低其丰度达48.41%,而P1与P0处理间没有显著差异；不同磷肥施用量对散囊菌纲和座囊菌纲相对丰度没有显著影响。

采用LEfSe方法,在属水平上对真菌群落进行差异物种分析,结果如图3所示。Sagenomella、Simplicillium、Magnaporthiopsis、Schizothecium和Nigrospora等5个属相对丰度在P0处理中最高；Plenodomus、Penicillium和Arthrobotrys等3个属相对丰度在P1处理中最高；而Cyphellophora、Zopfiella、Guehomyces、Mortierella和Mucor等5个属相对丰度在P2处理中最高。

2.4 真菌群落种间关系

采用SparCC软件分别计算3种磷肥施用量下真菌OTU之间的关系,结果如图4所示。其中图中每一个节点代表一个OTU,节点的大小代表其拥有的连接数量多少,不同节点颜色代表不同真菌门类；两个节点间的实线连接代表正相关关系,虚线连接代表负相关关系。对各网络中的节点数量进行统计,发现子囊菌门和担子菌门是3个网络中的优势菌。其中子囊菌门分别在P0、P1和P2处理中占所有节点数量的61.54%、72.12%和74.79%,而担子菌门分别为8.97%、6.73% 和6.72%。

图4 长期不同磷肥施用量对真菌群落网络组成的影响Fig.4 Co-occurrence network analysis of fungal communities relative to long-term P fertilization

不同磷肥施用量下网络参数如表2所示。其中平均路径长度表示网络中任意两点间的平均距离；网络直径代表任意两个节点距离中的最大值；平均聚类系数和模块性反应网络中节点聚集在一起的程度；平均度代表每个节点拥有的连接的平均值。所测网络模块性指数均高于0.4,说明3个网络均具有模块化结构。网络中连接的数量和平均度可用来表征网络复杂度,这两种指标均随磷肥施入量的增加而升高,说明施用磷肥可提高真菌网络复杂度,从而可能提高其稳定性。施用磷肥的P2和P1处理正相关比例增加,分别较P0处理高出10.43%和25.46%,而负相关比例分别比P0处理降低9.27%和22.63%。此外P0处理中具有较高的平均聚集系数,说明该处理中各节点聚集程度更高。

表2 长期不同磷肥施用量下真菌群落网络指标的变化Table 2 Key topological features of fungal community networks relative to long-term P fertilization

3 讨论

3.1 长期施用磷肥对真菌多样性的影响

我们之前的研究表明,在砂姜黑土区细菌α-多样性随着磷肥的施入而显著升高,而这主要与土壤中TP和DOC含量的升高有关[5]。而本研究结果表明,与细菌相反,真菌α-多样性随磷肥施入量的增加而不断降低的趋势,且与TP(r=-0.678,P=0.045)和AP(r=-0.677,P=0.045)均成显著负相关(图1)。He等[11]发现在青藏高原草甸土中连续三年施用磷肥后,真菌群落α-多样性显著降低。与之相似,Liu等[8]通过培育试验发现在红壤中施用磷肥后真菌α-多样性显著降低。施磷后真菌α-多样性的降低可能与土壤中P有效性变化有关。研究表明在低N∶P环境中(P丰富),细菌活性明显高于真菌,而在高N∶P环境中(P匮乏),真菌活性则显著高于细菌[13]。本研究中N∶P随着磷肥的施入而不断降低(表1),因此这种N和P有效性的变化可能更利于细菌的生长,从而导致细菌α-多样性升高,而真菌α-多样性降低。此外,施用磷肥后,土壤中捕食真菌的土壤动物增加,也可能导致真菌α-多样性的降低[8]。

主坐标分析结果表明不施用磷肥与施用磷肥处理的真菌群落结构沿着第一轴分开(图2),表明长期施用磷肥后真菌群落β-多样性发生明显变化。冗余分析的结果进一步表明TP和DOC是导致真菌群落结构差异的最主要环境因子(图2)。本研究中随着磷肥施入量的增加,土壤中TP含量显著升高(表1),而P0处理中磷含量的不足可能直接影响真菌的生长。磷是真菌生长所必须的营养元素,磷素不足可导致真菌DNA、RNA、功能酶和细胞壁等合成受阻,从而直接限制真菌生长[14]。此外真菌是农田土壤中植物残体的最主要分解者,而植物残体中C∶P远高于微生物[15],因此土壤磷素缺乏可能会影响真菌对有机碳的分解利用,从而间接影响真菌的生长。DOC升高是导致施磷后真菌群落结构变化的另一个环境因子。土壤中的真菌大多都是异养微生物,需要吸收外界碳来获取养分和能源[6]。不同微生物对碳有效性适应性不同,其中一些生长较快的r-策略型物种适宜在高浓度碳环境中,而一些生长缓慢的k-策略型物种则适宜在低浓度碳环境中[16]。前人的研究结果表明,pH对土壤真菌群落结构形成具有重要影响[17-18],而本研究中不同施磷处理间pH变化差异很小(5.22—5.53),因此可能对真菌群落结构影响并不显著。上述结果表明在砂姜黑土区长期施用磷肥后,土壤养分(TP和DOC)的变化是导致真菌群落结构发生改变的主要环境因子。

3.2 长期施用磷肥对真菌群落组成的影响

与以往本地区的研究结果相同,子囊菌门是砂姜黑土中的优势菌种[18]。在门和纲水平上进行单因素方差分析,发现子囊菌门及其门下的子囊菌纲均随着磷肥施入而显著升高(图3)。子囊菌门是土壤中主要的腐生营养型真菌,是土壤中动植物残体的主要分解者[19]。研究认为子囊菌门适于高肥力的土壤环境,其相对丰度随着氮肥、磷肥、秸秆的施入而显著升高[11,19-20]。本研究中长期施用磷肥后土壤中SOC、DOC、TP和AP等养分指标显著增加(表1),可能会有利于子囊菌门的生长。归属于子囊菌门的锤舌菌纲相对丰度在施磷处理中显著降低(图3)。研究表明锤舌菌纲可以与植物共生生长,其相对丰度与AP含量成极显著负相关[17,20-21]。因此可以推断作物在磷含量高的土壤中与锤舌菌纲共生模式减弱,导致该物种在高磷土壤中相对丰度显著降低。被孢霉菌门及被孢霉菌纲相对丰度在施用磷肥后也显著降低(图3)。研究表明被孢霉菌门中的一些真菌具有溶磷作用[7],可以溶解土壤中的难利用的磷素,因此可以推断其在低磷土壤中更具有生长优势。

采用LEfSe方法,在属水平上对真菌群落组成进行差异物种分析(图3)。结果发现P0处理中Simplicillium、Magnaporthiopsis、Sagenomella和Nigrospora等相对丰度最高,其中Simplicillium和Magnaporthiopsis为植物病原菌[22-23],Sagenomella和Nigrospora为植物内生菌[24-25]。而Penicillium、Mortierella、Mucor和Zopfiella等则在施磷处理中显著升高,其中Penicillium、Mortierella和Mucor均为腐生营养型真菌[26-27]。上述结果表明长期施用磷肥可提高土壤中腐生营养型真菌,降低共生和病原型真菌相对丰度。与我们的研究结果相似,Song等[10]研究发现经过21年连续施用磷肥后土壤中腐生营养型真菌增多,而共生的丛枝菌根真菌显著降低。一个可能的解释是,长期施用磷肥后,作物秸秆和根系残留物增多,土壤中的腐生营养型微生物可以通过分解植物残体获得养分和能量,在土壤中具有较高的竞争力。丛枝菌根真菌与植物共生生长,可促进植物对土壤中矿质养分(尤其是磷)的吸收,而磷肥的施用导致土壤养分(P)含量升高,植物对丛枝菌根真菌的依赖性降低,导致其相对丰度降低[10]；在缺磷施肥土壤中,植物秸秆和根系残留量较少,此时腐生营养型微生物由于没有充足的外源有机物料补充,而失去竞争优势,这时土壤中的植物病原菌、植物内生菌等可以通过寄生或共生的方式通过宿主获取养分和能量,从而具有较强的竞争力。此外,Zopfiella在施磷土壤显著升高(图3),研究表明Zopfiella可通过分泌抗真菌化合物,抑制植物病原菌,从而控制植物病害[28]。

3.3 长期施用磷肥对真菌种间关系的影响

研究对3种磷肥施用量下真菌群落进行网络分析,探索长期施用磷肥对真菌群落种间关系的影响(图4)。首先,长期施用磷肥下网络中子囊菌门比例逐渐增多,而担子菌门比例逐渐减少。研究表明子囊菌门主要分解新鲜植物残体,而担子菌门主要分解难利用碳[29]。这种物种营养习性的变化可能与土壤中C的有效性有关,本研究中长期施用磷肥后土壤中易利用的DOC含量显著升高,可能导致子囊菌在网络关系中比例增多。其次,随着磷肥施用量不断升高,真菌网络连接数和平均度也随之升高(表2),意味着施用磷肥后真菌物种之间的直接作用增多,而间接作用减少,而这种网络复杂度的增加会导致网络更加稳定,对外界环境变化“抵抗性”更强[30]。与我们的研究结果相似,Feng等[31]研究发现长期施用磷肥可以增加细菌物种间的关联,从而减少环境对物种筛选作用。最后,我们发现施用磷肥后物种之间正相关作用比例增加,而负相关作用比例减少(表2)。这可能是由于P0土壤中养分(尤其是TP和DOC)含量较低,各物种为争夺养分而导致竞争作用增多,而施磷土壤中由于养分资源充足,因此各个物种间正相关比例增多。值得注意的是P1处理中正相关连接比例最高,这种正相关连接的增加有利于形成更多的营养级,物种之间通过资源或代谢产物互补使得养分利用更为高效[32]。此外随着磷肥的施入,平均聚类系数逐渐降低,这说明长期施用磷肥增加可土壤异质性,可满足不同生态位真菌生长；而不施磷肥土壤中较高的平均聚类系数意味着其内物种功能的高度一致性,环境因子的筛选作用较强,只有那些适应缺磷条件的物种存在于网络中。

前人的研究结果表明,在砂姜黑土区长期施用磷肥可显著提高砂姜黑土土壤肥力,提升地上作物产量[1-3]。而本研究的结果进一步表明,长期施用磷肥还可明显改变地下真菌群落多样性、组成和种间关系。施磷后土壤中Penicillium、Mortierella和Mucor等腐生营养型真菌的增多有助于土壤有机质的转化,Simplicillium和Magnaporthiopsis等植物病原菌的减少有助于减缓作物病害。此外磷肥施用还可提高真菌网络复杂度和稳定性。这些结果有助于我们了解地下微生物群落与土壤环境因子、地上作物之间关系。

4 结论

经过21年不同磷肥施用梯度后,真菌多样性随磷肥施用量的增多而有降低的趋势,并与土壤TP和AP成显著负相关。磷肥施用显著改变了真菌群落组成,而这主要与土壤养分(TP和DOC)的变化有关。磷肥的施用刺激腐生营养型真菌的生长,但导致病原型和共生/寄生型真菌相对丰度降低。此外长期施用磷肥还可增加真菌群落结构的复杂度和稳定性。