“青霉菌培养与观察”实验探讨

刘雅清 杜 娟 徐 娟

（华东师范大学第二附属中学附属初级中学 上海 200241）

“青霉菌培养与观察”是《上海市中学生生命科学课程标准》初中阶段主题3“生物的主要类群”中“微生物”部分的实验内容。教材中提供的培养青霉菌的方法是将新鲜橘皮置于温暖、潮湿的环境培养1 周左右，橘皮上长出的青绿色的菌落即为观察对象。利用该培养方法得到的青霉菌往往过于成熟，很难找到基内菌丝或营养菌丝及产孢子结构共存的最佳视野，往往看到的都是高密度散落的绿色孢子。在青霉菌的观察方法上，教材中指导学生利用解剖针或者镊子挑取少许菌丝放在水滴中，制成临时装片在显微镜下观察。而此观察方法对学生的操作技术要求较高，且孢子很容易散落，较难观察到完整的青霉菌产孢子结构。

为了解决上述培养、观察青霉菌方法中存在的问题，本实验对青霉菌的培养和观察方法进行了改进。首先，观察用的青霉菌皆来源于利用PDA 培养基在实验室培养所得的培养平板，利用PDA 培养基极大缩短了青霉菌的培养时间，经过多次实验也得到了观察青霉菌形态结构的最优培养时间。其次，优化了制作青霉菌临时装片的方法，采用透明胶带粘附法使学生较易制得目标装片，并观察到完整的青霉菌结构，降低了实验操作难度，缩短了实验操作时间。最后，全部的实验操作过程中，青霉菌始终生长在培养皿基质内，避免了霉菌孢子散落在空气中被学生吸入而引发身体不适，并且也方便实验结束后的菌种保藏和霉菌处理。

1 实验材料

土豆、纱布、葡萄糖、橘皮培养的青霉菌原始菌种、涂布棒、无菌水、无菌平皿、显微镜、载玻片、盖玻片、透明胶带、剪刀、镊子、吸水纸、纱布等。

实验环境：显微数码互动实验室。

2 青霉菌的培养

2.1 PDA 培养基的配制 土豆洗净去皮切成小块,称取200 g 加水煮烂（煮沸20 min，能被玻璃棒戳破即可）。用8 层纱布过滤，滤液中加入20 g葡萄糖，搅拌均匀，再补足水分至1 L，分装锥形瓶。按照1.5%～2%的比例称量琼脂并分装到锥形瓶中，加塞、包扎，115℃灭菌30 min，摇匀，冷却至55℃左右倒平板，备用。

2.2 青霉菌的接种 在超净工作台中，用灭菌后的涂布棒将橘皮上的青霉菌原始菌种转到装有20 mL 无菌水的平皿中，混匀制成孢子液；利用涂布棒将上述制得的菌液接种到若干PDA 固体平板中。

2.3 青霉菌的培养条件 将接种好的青霉菌固体平板置于28℃恒温培养箱培养30 h，培养箱内保持一定湿度。具体培养时间以青霉菌长势情况为准，最佳长势为白色菌落上刚刚呈现出绿点，此时终止培养并置于冰箱冷藏备用。由于青霉菌在冷藏状态下仍然保持低速繁殖的模式，所以冷藏备用的时间不能超过48 h。

2.4 青霉菌菌种保藏方法 待培养皿中青霉菌菌落成熟后（绿色菌落），用保鲜膜或者封口膜包扎好置于冰箱冷藏，可保存数年，使用前取出转接新配制的PDA 培养基活化即可［1］。

3 青霉菌的显微观察

3.1 临时装片的制作 剪一条1～2 cm 长的透明胶带，轻轻沾取青霉菌培养皿中略带有绿色孢子的白色菌丝部分（切勿用手按压胶带），将沾有青霉菌的胶带粘在载玻片上。沾取青霉菌后立即盖好培养皿盖，以防吸入大量孢子。

3.2 显微观察方法 将临时装片置于显微镜载物台上，在10 倍物镜下寻找带有“扫帚”样的青霉菌产孢子结构的物像，将该物像调至视野中央，换40 倍物镜观察。

3.3 观察结果呈现

图1 青霉菌显微图像（10×40 倍）

图1 为10×40 倍放大倍数下青霉菌的显微图像，可以清楚地观察到完整的“扫帚”样产孢子结构及直立的分生孢子梗，且能追踪到“扫帚”样产孢子结构顶端即将散落和已经散落的分生孢子。

4 教学效果讨论

从学生观察到的青霉菌显微图像结果呈现来看，视野中能清晰地看到青霉菌“扫帚”样产孢子结构及直立的分生孢子梗，且能追踪到“扫帚”样产孢子结构顶端成串的成熟孢子即将散落的过程，帮助学生更好地理解为什么操作过程中要尽量避免空气流通，以防吸入大量孢子。青霉菌在固体培养基中要经历3 个生长阶段：第1 阶段是基内菌丝和气生菌丝的生长；第2 阶段在气生菌丝上长出直立的分生孢子梗，继而在分生孢子梗顶端形成成串的孢子，此结构即为显微镜下能观察到的“扫帚”样产孢子结构；第3 阶段孢子会大量繁殖，密集地覆盖在气生菌丝上［2］。观察青霉菌的最佳时期是当青霉菌生长至第2 阶段初期，此时在直立的分生孢子梗的顶端刚好形成成串的孢子，进行显微观察时视野中有大范围能够锁定目标的观察物，而此阶段经历的时间非常短，仅停留几小时［1］，所以优化青霉菌的培养是非常必要的，本实验很好地解决了该问题。

本实验在青霉菌的观察方法上做了改进，利用胶带粘附的方法大幅降低了学生操作的难度，使其有充足的时间观察菌丝和产孢子结构，从上述结果呈现来看实验效果很好。同时，胶带粘附法可以将菌体生长的状态完好地保留下来，避免了因青霉菌孢子在制作装片过程中的散落而影响观察效果。