温光诱导下甜菜蛋白质组学研究

梁乃国，程大友，崔 杰，代翠红，罗成飞

(哈尔滨工业大学化工学院，哈尔滨 150090)

0 引言

温度和光周期是植物开花的两个主要环境因素。当环境条件最有利时开花是植物生殖生长重要的适应性特征。春化是植物对温度的一种适应性，植物长时间暴露于低温条件下之后获取开花能力的过程。春化作用诱导细胞的快速分裂，分生组织一旦长时间处于春化环境，它们不但会记住春化作用，而且该记忆在有丝分裂上是稳定的。大多数植物的开花需要春化和长日照光周期的诱导作用，长日照光周期为开花提供了保证，研究光周期诱导植物开花的分子机制表明，光感受器和昼夜节律性调节以复杂的方式相互作用控制开花的转变，光周期诱导开花是昼夜节律调节的输出通路。拟南芥的春化和光周期诱导开花的分子机制已经研究得比较清楚。但是甜菜作物中的春化和光周期途径诱导开花的分子机制仍不明确，最近的研究表明，除了相关基因的转录调控之外，春化和光周期诱导开花的机制还受到蛋白质稳定性和蛋白质降解作用的调节。因此，研究不同条件下甜菜不同发育时期蛋白质组学的表达差异可以进一步明确春化和光周期途径的调控机制。

1 材料和方法

1.1 生物材料及处理方法

实验材料为糖甜菜品系DY14-O，该材料为二倍体、糖甜菜品系。选大小基本一直的母根200个，用钢锯沿着甜菜母根根体纵向平均分瓣，对应编上号码，共400瓣。其中200瓣春化(4-5℃)处理16周(16W);另外对应的200瓣在正常条件下(非春化条件下)处理16周(16W)。在春季将二者同时移栽到试验田中，200瓣春化甜菜中的100瓣长日照(光照16 h/黑暗8 h)条件下生长，其余的100瓣短日照(光照8 h/黑暗16 h)条件下生长。另外的200瓣非春化甜菜中的对应的100瓣长日照(光照16 h/黑暗8 h)条件下生长;另外对应的100瓣短日照(光照8 h/黑暗16 h)条件下生长。在甜菜苗期(16W)、抽薹期(19W)和现蕾期(20W)分别采集叶片，用锡箔纸包好后迅速放入液氮中速冻转移至-80℃冰箱中保存。

1.2 实验方法

利用(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术对保存的样品—甜菜春化长日照与春化短日照、春化长日照与非春化长日照、春化短日照与非春化短日照、非春化长日照与非春化短日照的苗期(16W)、抽薹期(19W)和现蕾期(20W)叶片中蛋白质的表达差异进行分析，以期明确春化、光周期诱导对甜菜蛋白质组学差异的影响。

2 结果与分析

2.1 蛋白质鉴定

如表1所示，通过对甜菜春化长日照和春化短日照、非春化长日照和非春化短日照甜菜不同发育时期叶片中差异表达蛋白质分别进行Significance A检验，显著性分析(p-Value，P<0.05为显著性差异)共发掘出1 435个差异表达蛋白质。

表1 差异蛋白质结果统计

(P<0.05，ratio>1.2 or<0.833)

2.2 春化和光周期差异蛋白质的GO富集和KEGG途径分析

为了进一步明确春化与非春化、长日照与短日照反应的蛋白质差异，将16W(苗期)、19W(抽薹期)和20W(现蕾期)鉴定出的差异蛋白质(DRPs)应用Blast2GO (Version 2.7.2)进行GO富集分析，显著性低于0.05认为GO显著性富集；然后应用KEGG数据库进行KEGG途径绘图分类特征化春化与非春化、长日照与短日照相关的DRPs功能序列，选择P-value低于0.05的KEGG途径分类为显著性富集。春化与非春化的KEGG途径分类结果表明“植物激素信号转导、氮代谢、谷胱甘肽代谢和二萜生物合成”的DRPs显著富集，且在春化甜菜16W和20W特异性下调;KEGG 途径“内质网中蛋白质加工“的DRPs在16W时富集，且在春化甜菜19W叶片中特异性上调；“苯丙素生物合成”的DRPs在16W和20W时下调而在春化甜菜19W时期的叶片中显著上调，如表2所示。春化作用影响甜菜发育过程中的苯丙素生物合成、二萜生物合成、植物激素信号转导和内质网中蛋白质的加工。光周期影响 “光合作用”，“光合作用天线蛋白质”，“谷胱甘肽代谢”和“乙醛酸和二羧酸代谢”的DRPs高度富集，且在短日照16W和19W时特异性上调，而 “mRNA监测途径”的DRPs只在长日照20W时的叶片中富集。KEGG分类如表3所示。

表2 春化与非春化蛋白质的KEGG途径富集分析

表3 长日照与短日照光周期蛋白质的KEGG途径富集分析

2.3 春化和光周期协同作用的蛋白质

将春化与非春化甜菜16W、19W和20W时叶片中的差异蛋白质分别与长日照和短日照甜菜16W(苗期)、19W(抽薹期)和20W(现蕾期)时叶片中的差异蛋白质进行综合性筛选分析，筛选出春化与非春化、长日照与短日照同一时期共有的、显著性变化的蛋白质，甜菜16W春化和光周期协同作用的蛋白质共39个，这些蛋白质主要是核糖体蛋白，ATP合成蛋白和过氧化物酶体膜蛋白，其中春化和长日照光周期协同诱导30个蛋白质表达上调表达，而非春化和短日照协同诱导9个蛋白质上调表达。19W时春化和光周期协同作用的蛋白质共22个，这些蛋白质主要是核糖体蛋白，组蛋白和转录因子蛋白，其中春化和长日照光周期协同诱导5个蛋白质表达上调，而非春化和短日照协同诱导17个蛋白质上调表达。20W时春化和光周期协同作用的蛋白质共8个，这些蛋白质主要是丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶和磷酸化酶蛋白、葡聚糖内切-1,3-β-葡糖苷酶和前体、半胱氨酸蛋白酶和硫氧还蛋白，其中春化和长日照光周期协同诱导3个蛋白质表达上调，而诱导5个蛋白质下调表达。

2.4 甜菜抽薹和开花相关的蛋白质

2.4.1 甜菜抽薹相关的蛋白质

共鉴定出22个与甜菜抽薹相关的蛋白质，如表4所示。这些蛋白质分布为光合系统Ⅰ和光合系统Ⅱ蛋白质、抗坏血酸过氧化物酶蛋白质、40S核糖体蛋白质S29、核糖体蛋白质S14和60S核糖体泛素化蛋白质、铁氧还蛋白质、组蛋白去乙酰化酶蛋白质、组蛋白赖氨酸甲基化转移酶蛋白质、过氧化物酶体蛋白质和转录因子蛋白质。蛋白质GO富集分类显示电子载体活性相关的蛋白质含有3个、催化活性相关的蛋白质含有6个、分子结构活性相关的蛋白质含有2个、连接相关的蛋白质含有15个，如图1所示。电子载体活性相关的蛋白质和分子结构活性相关的蛋白质是甜菜抽薹期特有的，与抽薹直接相关。

表4 甜菜抽薹相关的蛋白质

X表示春化与非春化，长日照与短日照处理，甜菜叶片中蛋白质比值变化，显著性为P<0.05。

注：Y轴表示蛋白质的数量和百分比，X轴表示GO富集分类，A：电子载体活力B：催化活力C：结构分子活力D：结合图1 甜菜抽薹期春化和光周期协同诱导的蛋白质功能分类

2.4.2 甜菜抽薹相关蛋白质的相互作用分析

植物体中的蛋白质相互之间具有调控作用，形成调控网络。为了明确甜菜中蛋白质之间的相互调控与抽薹发育的关系，将抽薹相关的蛋白质通过String(http://string-db.org)数据库进行分析。预测到4个相互作用的网络，如图2所示。叶绿体中的光系统I反应中心亚基psaK蛋白质、叶绿体中光系统II核心复杂蛋白质psbY、叶绿体中光系统I反应中心亚基N、叶绿体中氧进化蛋白质增强子2、叶绿体中氧进化蛋白质增强子3和铁氧还蛋白质2形成相互调控的网络，它们之间具有显著性的相互作用，该调控网络又与叶绿体中光系统I反应中心亚基VI蛋白质具有显著性的相互作用。值得注意的是抽薹相关的蛋白质中有两对显著性相互作用的群体，一对由核糖体蛋白质S14和泛素化60S核糖体蛋白质L40组成；另一对由叶绿体中的铁氧还蛋白-硫氧还蛋白还原酶催化链和光系统II磷蛋白质组成。

图2 抽薹相关调节蛋白相互作用的网络分析

2.4.3 甜菜开花相关的蛋白质

共得到19个与甜菜开花相关的蛋白质，如表5所示。它们的分布为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶核酮糖二磷酸羧化酶蛋白质和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶蛋白质、叶绿素a-b结合蛋白质硫氧还蛋白质半胱氨酸蛋白酶抑制因子、半胱氨酸蛋白酶和光敏色素相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。GO富集分析表明抗氧化活性相关的蛋白质是甜菜开花期特有的，与开花直接相关，如图3所示。

表5 甜菜开花相关蛋白质

续表5

X表示春化与非春化，长日照与短日照处理，甜菜叶片中蛋白质比值变化，显著性为P<0.05。

注：Y轴表示蛋白质的数量和百分比，X轴表示GO富集分类，A：催化活力B：结合C：抗氧化活力图3甜菜开花期春化和光周期协同诱导的蛋白质功能分类

2.4.4 甜菜开花相关蛋白质的相互作用分析

甜菜开花相关的蛋白质相互之间形成调控网络，促进甜菜开花。将开花相关的蛋白质通过String (http://string-db.org)数据库进行分析。预测到2个相互作用的网络，如图4所示。一个是由叶绿体中的叶绿素a-b结合蛋白质6、叶绿素a-b结合蛋白质和叶绿素a-b结合蛋白质4组成的调控网络，它们之间具有显著性的相互作用。另一个是由1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基和核酮糖二磷酸羧化酶小链蛋白质组成的调控网络。

图4 开花相关蛋白质相互作用的网络分析

3 结论

(1)春化作用影响甜菜发育过程中苯丙素生物合成、二萜生物合成、植物激素信号转导和内质网中蛋白质的加工。光周期影响光合作用、乙醛酸和二羧酸代谢、谷胱甘肽代谢和mRNA监测途径。

(2)春化和光周期协同诱导下，甜菜19W时期叶片中染色质结构和动力学相关的蛋白质可能与甜菜的抽薹直接相关。抗氧化活性相关的蛋白质和酶活性调节因子是甜菜20W时期特有的蛋白质，表明这两类蛋白质可能促进了甜菜的开花。