奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验

杜 琳，王丽芳，冯小慧，张三粉，宋 洁，姚一萍，史 培

（内蒙古自治区农牧业科学院，呼和浩特 010010）

奶牛乳房炎是一种重要的奶牛疾病，主要是奶牛的乳腺组织受到物理、化学或微生物方面等因素刺激而引起的一系列炎性反应[1]，可以造成巨大的经济损失[2-4]。引起奶牛乳房炎的病原菌种类繁多，常见的病原菌有传染性病原菌（金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌）和环境性致病菌（大肠杆菌和克雷伯氏菌等）。奶牛乳房炎不仅给乳制品加工业带来巨大损失，而且还危害公共卫生安全和人类的健康[5]。目前，抗生素仍然是治疗奶牛乳房炎的主要手段。随着抗生素的不合理使用，导致奶牛乳房炎病原菌的耐药性越来越明显，甚至出现“超级细菌”[6]。同时残留在牛奶中的抗生素也会引发部分消费者发生过敏等变态反应，长期饮用更可增加机体内细菌对抗生素产生耐药性的可能[7]。金黄色葡萄球菌作为引起乳房炎的主要致病菌，其耐药性引起了人们的广泛关注[8-9]。

1 材料与方法

1.1 材料营养肉汤、甘露醇氯化钠琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司； 药敏试验药物：氟苯尼考、氨曲南、利福平、氧氟沙星、复方新诺明、氯霉素、万古霉素、头孢西丁、青霉素、庆大霉素、四环素、环丙沙星、克林霉素、苯唑西林、妥布霉素、利奈唑胺、美罗培南、阿莫西林-克拉维酸、红霉素和氨苄西林，由上海星佰生物技术有限公司定制成药敏板；2×Easy Taq®PCR Super Mix、细菌基因组 DNA 小量纯化试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；DL2000 DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 在生鲜乳主产地区内蒙古自治区、黑龙江省、山东省、上海市、河北省共收集247批次患乳房炎病牛乳样。其中内蒙古自治区、黑龙江省、上海市、河北省各50份样本，山东省47份。

1.2.2 细菌的分离培养 将无菌采集到的乳样用灭菌棉拭子于甘露醇氯化钠琼脂培养基划线培养，37℃培养16 h后观察菌落形态。挑取疑似菌落经革兰氏染色镜检，进行纯培养，并对分离获得的流行菌株编号，对分离时间、分离地点等信息进行记录归档。

1.2.3 分子生物学鉴定 参照细菌基因组 DNA 小量纯化试剂盒说明书，提取细菌基因组DNA。

以提取的DNA为模板，PCR扩增16S rDNA基因。根据GenBank登录的DNA序列设计通用引物，Bacterial 16s-F：5'-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGG CT-3'，Bacterial 16s-R：5'-CGCGGATCCGCTA CCTTGTTACGACTT-3'。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，75℃延伸90 s，共30个循环；72℃再延伸10 min。预期目的条带大小为1500 bp。

将PCR产物纯化后连入pEasy-T1载体，转化至Trans-T1感受态细胞中，选取阳性克隆送上海生工生物科技有限公司进行测序。所测基因序列与GenBank中已有序列进行Blast同源性比对。

1.2.4 药敏试验 对分离出的主要病原菌进行药敏试验，按照CLSI推荐的肉汤稀释法进行，用大肠埃希氏菌标准菌株（ATCC25922）、粪肠球菌标准菌株（ATCC29212）、金黄色葡萄球菌标准菌株 （ATCC29213）、铜绿假单胞菌标准菌株（ATCC27853）作为质控菌，根据CLSI（2016）的标准判断其耐药性。

2 结果

2.1 细菌的分离鉴定结果

2.1.1 细菌的分离 247份乳样中共分离得到40株葡萄球菌，其中产色葡萄球菌1株，表皮葡萄球菌2株，巴氏葡萄球菌1株，松鼠葡萄球菌1株，腐生葡萄球菌5株，金黄色葡萄球菌30株，金黄色葡萄球菌分离率为12.15%。

金黄色葡萄球菌阳性率最高的是黑龙江省，分离率为24%；上海市和山东省两个地区的分离率较低，分别为12%和8.5%。河北省未分离出金黄色葡萄球菌。

2.1.2 菌株的形态学鉴定 金黄色葡萄球菌在高盐甘露醇培养基上生长，呈黄色菌落，周围有黄色的环，菌落形态见图1。分离株呈革兰氏阳性，葡萄串状（图2）。

图1 金黄色葡萄球菌的菌落形态Fig. 1 Colony morphology of Staphylococcus aureus

图2 金黄色葡萄球菌的菌体形态Fig. 2 Morphology of Staphylococcus aureus under the oil microscope

2.1.3 分子生物学鉴定 对疑似菌株进行16S rRNA基因的扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在约1500 bp处扩增出条带，与目的片段大小相同。取16S rRNA的PCR产物进行测序分析并Blast比对，30株为金黄色葡萄球菌，1株为产色葡萄球菌，2株为表皮葡萄球菌，1株为巴氏葡萄球菌，1株为松鼠葡萄球菌，5株为腐生葡萄球菌。

金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎主要传染性病原菌，能够损害乳房上皮细胞和腺泡，导致奶牛产奶量急剧下降，严重时可致奶牛死亡[10]。由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎占20%～50%[11]。本调查中金黄色葡萄球菌的感染率（12.15%）明显偏低，表明金黄色葡萄球菌在奶牛乳房炎中已经得到了初步控制。

2.2 药敏试验结果

2.2.1 金黄色葡萄球菌的耐药情况 本研究中用于耐药性试验的20种药物来自11大类药物，其中β-内酰胺类7种、氨基糖苷类2种，四环素类1种，磺胺类1种，喹诺酮类2种，林可酰胺类1种，大环内酯类1种，氯霉素类2种，糖肽类1种，噁唑烷酮类1种，安莎霉素类1种。

由于金黄色葡萄球菌感染一直采用抗生素疗法，使其耐药性问题日益严重，给金黄色葡萄球菌性乳房炎的治疗带来了很大的困难。本研究分离的30株金黄色葡萄球菌大部分具有不同程度的耐药性，并且80%为多重耐药菌（表1）。其中，耐单一药物的有6株（20%）。耐药种类数最多的1株金黄色葡萄球菌，能够耐受11种药物。单种药物药敏结果表明，所分离得到金黄色葡萄球菌对氨曲南的耐药率最高，达到了100%，其次为青霉素（80%）、氧氟沙星（43.33%）、头孢西丁（43.33%）和美罗培南（43.33%）耐药率，均高于40%。耐药率低于10%的为氟苯尼考（全部敏感）、万古霉素（全部敏感）、苯唑西林（全部敏感）、利奈唑胺（全部敏感）、阿莫西林-克拉维酸（全部敏感）、氯霉素（3.33%）、复方新诺明（3.33%）、利福平（6.67%）和环丙沙星（6.67%）。检测结果与王秋冬等2017年报道金黄色葡萄球菌耐药性[12]和徐佳2015年报道的结果[13]有一定差异，可能不同年份、不同地区分离的金黄色葡萄球菌耐药性存在差异。

2.2.2 金黄色葡萄球菌耐药性区域情况比较 对各种抗生素而言，山东省分离的金黄色葡萄球菌耐药率明显小于其他三个地区的平均耐药率，上海市分离的金黄色葡萄球菌具有最高的平均耐药率。对于喹诺酮类，内蒙古自治区分离的金黄色葡萄球菌平均耐药率最高（环丙沙星12.5%，氧氟沙星75%）；对于磺胺类、氯霉素类，黑龙江省分离的金黄色葡萄球菌具有最高的平均耐药率（复方新诺明8.33%，氯霉素8.33%）；对于安莎霉素类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、林可酰胺类、大环内酯类，上海市分离的金黄色葡萄球菌具有最高的平均耐药率（利福平33.33%、头孢西丁83.33%、青霉素100%、美罗培南83.33%、庆大霉素33.33%、妥布霉素83.33%、林可霉素66.67%、红霉素50%）。金黄色葡萄球菌的耐药性在地方分布上有所差异，可能与不同地区的饲养环境和饲养过程中抗生素的使用不同等因素有关。因此，为了避免临床上抗生素的滥用，进行金黄色葡萄球菌的耐药性监测尤为重要。使用兽药时应根据各地区流行菌株的耐药特点，选择敏感性高的药物。同时在使用敏感性较高的药物时，要考虑到动物禁用药物及泌乳期禁用药物等因素，规范抗生素的使用，防止乱用、滥用抗生素，并且进一步探索除抗生素外的治疗和预防手段，如亚单位疫苗、噬菌体、中草药等方法。

表1 金黄色葡萄球菌的药敏试验结果Table 1 Drug susceptibility test results of Staphylococcus aureus