乳脂肪干法分提组分化学组成及热力学特性

王筠钠，李 妍，李 扬，尹未华，张列兵,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.北京工商大学食品学院，北京 100048）

乳脂肪在乳中以脂肪球颗粒形式存在，呈高度乳化状态，约占乳总量3%～5%，其中约含甘油三酯（triglyceride，TAG）（98±1）%、磷脂1%和人类必需游离脂肪酸（fatty acid，FA）、甾醇及脂溶性维生素等，是提供人体能量的高营养物质[1-2]。乳脂肪化学结构复杂，含不同性质油脂成分。为获取不同性质脂肪、满足不同乳制品需求，通常需将不同熔点下的固体脂以结晶形式从液体油中分离出来。乳脂肪分提方法主要有干法分提、溶剂分提、乳化分提等。干法分提是先让油脂在控制条件下冷却结晶，然后通过固液分离技术，将固脂与液油分离，是一种不附加其他措施及试剂的分离技术，较其他方法所得级分更为纯净[3-4]。

干法分提技术是在保持原有营养特性基础上可得到物理化学性质不同的系列脂肪，进而获得更加丰富的下游衍生产品，充分展现了不同级分乳脂肪的功能特性。分提后的乳脂肪中低熔点级分可用于制备蛋挞稀奶油、咖啡伴侣等产品，中高熔点级分可制备搅打稀奶油、起酥油等，或作为填料添加[5]。Hartel[6]将乳脂肪分离成高、低熔点组分后进行适当组配，再通过添加其他所需成分，调整熔点、组织结构和口感，调配出适于工业化生产的具有不同功能特性的系列乳脂肪，满足了稀奶油、冰淇淋、糕点、奶酪、炼乳等不同产品所需。干法分提拓宽了乳脂肪应用范围，丰富了乳制品市场，为乳品工业发展开辟了新途径。

目前相比国外，我国人口多、奶源少，干法分提受原料来源、分提技术和加工成本等多因素制约，分提研究与应用仍多停留在对棕榈油、椰子油等植物油上，而对乳脂肪研究甚少[7]。

本实验采用逐级升温方式进行乳脂肪干法分提，获得了不同熔点组分，分析研究干法分提对乳脂肪理化性质的影响，并比较各组分间化学组成、热力学性质、结晶特性等差异，力求为乳脂肪工业化加工及生产提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳脂肪（含脂99.99%） 新西兰恒天然有限公司；混合FA甲酯标准品（色谱纯） 中国Sigma有限公司；正己烷、氯仿、甲醇、乙腈（HPLC级） 北京迪马试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪（配有NIST数据库）、AOC-5000自动进样系统、LabX XRD-6000X X射线晶体衍射（X-ray diffraction，XRD）仪 日本岛津公司；1290-6460超高效液相色谱-串联质谱联用仪美国安捷伦公司；CR7N冷冻离心机 日本日立公司；Q2000差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC） 美国TA公司。

1.3 方法

1.3.1 乳脂肪分提工艺

乳脂肪干法分提熔化温度范围10～40 ℃，针对乳脂肪理化性质及其FA组成特性，采用逐级升温方式进行分提，温度设置为（20±1）、（30±1）、（40±1）℃三个梯度，所得分提级分为L20、L30、L40、S40，工艺流程见图1。

图1 乳脂肪逐级干法分提工艺流程Fig. 1 Flow char for multi-step dry fractionation of milk fat

乳脂肪放入－18 ℃冰箱冷冻，取出，加热到10 ℃，保持30 min，然后置于20 ℃恒温箱熔化平衡24 h，以3 000 r/min离心30 min，得到液体油L20和固体脂S20；然后将S20继续升温至30 ℃，同样熔化平衡24 h，离心分离得到L30和S30，以此类推得到L40和S40。

1.3.2 FA分析

根据GB 5413.27—2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定》对乳脂肪样品进行甲酯化，过0.2 μm有机滤膜，进气相色谱-质谱联用仪分析。色谱条件：DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：起始温度40 ℃，保持3 min，先以5 ℃/min升温至120 ℃，再以10 ℃/min升温至200 ℃，保持13 min；进样口及离子源温度200 ℃；载气（He）流速1.6 mL/min，不分流进样；质量扫描范围m/z 35～500；溶剂延迟2 min。

1.3.3 TAG分析

1.3.3.1 样品前处理

取0.2 mL冰乙酸加入到120 mL乙腈和80 mL异丙醇混合溶液中，制成酸化液。取5 mg乳脂肪样品溶解于1 mL氯仿中，制成乳脂肪氯仿液；吸取乳脂肪氯仿液0.1 mL，用酸化液定容至10 mL，充分振荡混匀，备用。同法配制5 mg/mL FA甘油酯标准液。

1.3.3.2 超高效液相色谱条件

流动相A为冰乙酸-乙腈（1∶9，V/V）混合液；流动相B为冰乙酸-异丙醇（1∶9，V/V）混合液；选用Angela C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm），柱温60 ℃。

洗脱条件：用40% B-60% A洗脱1～2 min，用55% B-45% A洗脱3.5～4.5 min，再用40% B-60%A洗脱4.6～5 min并维持1 min，进样量5 μL，流速0.3 mL/min。

1.3.3.3 质谱条件

质谱仪参数：扫描模式为MS2Scan母离子扫描，m/z 400～1 200，裂解电压10 V。子离子m/z 100～母离子，裂解电压10 V，碰撞能量30 eV。

1.3.3.4 分析方法

TAG组成确定后，从完整的质子扫描的色谱图中提取各TAG [M＋NH4]＋的m/z离子流，积分各单一m/z的提取离子流。

1.3.4 热力学性质分析

采用DSC分析样品非等温结晶-熔化热力学性质。温控程序为：将样品升温至80 ℃消除历史结晶，以5 ℃/min降温至－20 ℃，保持2 min后，以5 ℃/min升温至50 ℃，记录结晶和熔化过程的热力学曲线。

1.3.5 晶型分析

XRD用于研究TAG同质多晶现象。样品25 ℃恒温48 h，在25 ℃测定晶体结构。X光管为陶瓷型，光管功率2.2 kW，使用带有Ni滤光镜的Cu-Ka放射源（k=1.540 56 Å），电压和电流分别设定为40 kV和40 mA，发射狭缝、防反射狭缝、接受狭缝分别固定在1.0、1.0 mm和0.1 mm。2θ角扫描速率2.0°/min，步长0.02°，范围10.0°～30.0°。

1.4 数据分析

使用IBM SPSS Statistics 20（SPSS Inc, IL）进行单因素方差分析。数据平均值两两比较，分析差异显著性（P＜0.05）。所有数据（n=3）均采用均以 ±s表示。运用Origin 8.0统计软件处理实验数据，Prism 7.03绘制热图。

2 结果与分析

2.1 乳脂肪及其分提组分FA分析

按1.3.1节分提工艺，将原始乳脂肪分提为4 个组分：低熔点组分L20、中熔点组分L30和L40、高熔点组分S40，用气相色谱-质谱联用法进行FA种类及含量分析，结果见表1。

表1 乳脂肪及其分提组分FA种类及相对含量Table 1 Fatty acid composition of milk fat and its fractions%

从表1可以看出，不论分提级分如何小，每个组分依然是由不同链长饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）和不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid，USFA）构成的混合物，FA成分相近、比例不同，因此保持了组分整体相似性。TAG可分解为一分子甘油与三分子FA，其熔点受3 条FA碳链长度及不饱和程度影响，因此，TAG熔点是不同链长FA共同作用的结果[8-9]。例如，TAG各碳链FA熔点：C14:054.4 ℃、C16:062.9 ℃、C18:069.6 ℃、C18:116.3 ℃、C18:2－5 ℃，不难看出在相同饱和度下，碳链越长，熔点越高，在相同碳链长度下，饱和度越高，则熔点也就越高。此分提过程主要基于乳脂肪中各个甘三酯熔点差异，而单个FA熔点仅起到间接作用[10]。

各分提组分（L20～S40）随着分提温度的升高，分提熔点也依次升高。从FA饱和程度来看，SFA含量呈递增而USFA呈递减趋势。与原始乳脂肪相比，L20中总SFA由80.14%降至70.72%，总USFA由17.86%升至29.28%，所以L20熔点较乳脂肪低。而S40中的SFA比例C16:0和C18:0分别升至29.24%和15.00%，C18:1、C18:2和C18:3分别降至6.09%、0.44%、0.23%，SFA上升，USFA下降，S40熔点相对较高。

从碳链长度来看，L20短中链SFA（C6:02.67%、C8:02.64%、C10:06.32%、C14:016.34%）和长链USFA（C18:119.84%、C18:24.36%、C18:31.76%）含量高，而长链SFA（C16:029.24%、C18:015.0%）含量较低。与之相反，S40短中链SFA（C6:00.91%、C8:00.55%、C10:05.47%、C14:015.90%）和长链USFA（C18:16.09%、C18:20.44%、C18:30.23%）较少，长链SFA（C16:029.24%、C18:015.0%）最高。结果表明总体趋势是短链SFA和USFA主要存在于液体油部分，而长链SFA保留在固体脂结晶部分，这些发现与Grail等[11]获得的结果相一致。

2.2 乳脂肪及其分提组分热图分析

乳脂肪是天然TAG最复杂的混合物之一，TAG含量约占乳脂肪的97%～99%，其理化性质是决定黄油、稀奶油等乳脂制品性能及品质的关键[12]。Himawan等[13]通过对油脂结晶热、动力学方面研究指出，TAG中FA组成与位置差异会在脂肪熔化与结晶时产生不同的位阻，影响结晶特性[14]；TAG中碳链长短和不饱和度也会影响结晶网状结构和结晶速率，因此相比FA，TAG的结构组成对脂肪理化性质影响更为重要。TAG按相对分子质量大小分为：小分子质量TAG（碳原子数26～34）范围498～610；中分子质量TAG（碳原子数35～40）范围624～694；大分子质量TAG（碳原子数41～56）范围708～918[15]。

对乳脂肪及其分提组分使用液相色谱-质谱联用进行TAG定性定量分析，因其种类繁多，所以只选取样品中共有的且含量较高的TAG进行热图汇总分析，用颜色渐变方式表示TAG含量变化，以便直观看出，见图2。

图2 乳脂肪及其分提组分TAG热图Fig. 2 Heat map of TAGs in milk fat and its fractions

由图2可知，逐级升温分提使得高熔点组分和低熔点组分的TAG含量之间存在显著差异（P＜0.05）。乳脂肪含饱和TAG（C36:0～C52:0）较多、不饱和TAG（C32:1、C38:1、C46:1）较少，L20含较多短中链SFA（C32:0、C36:0）及长链USFA（C50:1、C50:2、C52:1）组成的TAG。随着分提温度升高，S40中USFA（C32:1、C46:1～C46:3）及短链SFA（C36:0～C38:0）减少，而长链SFA（C40:0～C52:0）提高。

研究表明，含C32:1～C38:1FA链TAG易形成α晶型，但α晶型仅能存在较短时间，尔后便迅速转变为β’晶型。饱和TAG可促进β晶型形成，而β晶型要求甘油1,3位上两条碳链整体差异较小，一般由C16:0和C18:0FA组成[16]，本实验满足该结构要求的TAG为C52:0。β’晶型相比β晶型而言，晶体呈针状且细腻，可提高产品光滑性和空气包裹能力，使稀奶油具有更好可塑性和涂抹性。

另外，长链SFA有利于促成高熔点TAG，短链SFA倾向形成低熔点组分TAG。Ramadan等[17]报道称这种趋势反映了高熔点饱和TAG相对于低熔点不饱和TAG更易结晶。高熔点TAG，如三饱和TAG（StStP、PPP和StStSt），单不饱和TAG（StStO和OOPo）会因温度往复变化提供驱动力而聚集形成颗粒较大晶体。当贮存温度高时，低熔点TAG熔化，而此时高熔点TAG仍处于晶体状态，使得这些分子的晶体迁移并聚集形成大的晶体[18-19]。本实验中FA和TAG的化学组成结果表明，干法分提改变了乳脂肪各组分化学组成，从而相应改变了它们物理性质。

2.3 乳脂肪及其分提组分结晶-熔化热力学特性分析

FA和TAG组成显著影响脂肪结晶和熔化特性。在实际加工过程中，如稀奶油降温熟化，人造奶油急冷捏合，巧克力调温膨化都是在非等温条件下进行，因此就优化生产工艺参数和有效控制产品质量而言，采用DSC非等温模型，能有效反映脂肪结晶和熔化过程中的相变温度和焓值[20]，对其热力学行为提供数据支持。

各乳脂结晶-熔化曲线所对应峰值和热焓见表2。结晶峰的出现说明体系有结晶相变潜热发生，即乳脂肪在峰值温度下由液油相转变为固脂相时会放出热。反之，熔化峰说明体系有熔化相变潜热发生，即乳脂肪在峰值温度下由固脂相转变为液油相时会吸热，相变热绝对值越大，表明体系热容量越大。

图3 显示乳脂肪按逐级分提方式分成的4 个组分L20、L30、L40、S40，熔点温度依次升高。如图3A所示，随着温度降低，S40最先结晶（19.4 ℃），接着L40（14.88 ℃）、乳脂肪（13.23 ℃）、L30（8.62 ℃）、L20（7.99 ℃）依次结晶，这充分说明分提组分S40、L40、L30、L20中高熔点组分依次减少，低熔点组分依次增多。S40、L40、乳脂肪均有3 个放热峰，两端大，中间小，各峰值温度S40＞L40＞乳脂肪（P＜0.05），说明S40、L40与乳脂肪相比含更多高熔点组分，所以结晶峰值温度提高，放热焓增大[21]。

S40、L40、乳脂肪曲线第1个高温放热峰面积均小于最后一个低温放热峰面积，这是因为随着温度不断降低，过冷度增大，大量低熔点组分迅速结晶，故出现较大放热峰，结晶峰变宽。由于分子链并入晶格需要一定的豫迟时间，导致脂肪结晶滞后于降温过程，同时低温造成体系黏度增加，限制传热传质，使分子链活动能力降低，从而阻止TAG重排形成最稳定晶型，所以此时形成的晶体松散且不稳定[22]。

从图3B熔化曲线看出，L20和L30分别在9～10、10～18 ℃和19～28 ℃三个熔化峰，熔化温度跨度0～28 ℃，体系熔化相变潜热较小，热容量小，温度升高，固脂很快转变成液油。乳脂肪、L40和S40在6～10 ℃起峰，10～16 ℃为中温峰，20～45 ℃为高温吸热峰，熔化温度跨度－5～45 ℃，体系熔化相变潜热较高，固脂向液油转变较为缓慢，乳脂有一个相对稳定状态。这是因为L20和L30含较多低熔点TAG，所以脂肪结晶大部分在14 ℃附近熔化，L40和S40含较多高熔点TAG，则大部分在30 ℃附近熔化。L20～S40，吸热峰值温度和吸热焓不断递增，说明分提温度越高，所得乳脂肪组分熔点就越高，高温熔化时所需热能就大。

L40在34.29 ℃处吸热峰可能对应POP TAG（β晶型，熔点～35 ℃），S40在38.64 ℃处吸热峰可能对应StStSt TAG（β晶型，熔点～39 ℃）。同时，图3中发现同质多晶现象的存在导致吸热温度相对于放热峰温度滞后，结晶和熔化曲线无法完全对应。造成这种现象的原因有：1）脂肪TAG组成千差万别，含三饱和FA链TAG的熔点比多饱和、单饱和、多不饱和FA链TAG熔点高。两种或多种TAG同时熔化可能产生宽峰相互重叠；2）乳脂肪无绝对熔点，因为它由不同熔点TAG多晶型组合而成[23]。Fatouh等[24]提出乳脂的DSC熔化曲线中3 个吸热峰是由熔点不同的TAG分别熔化所形成的，结合分子质量与熔点关系，可认为这3 个吸热峰分别与小分子质量TAG、中等分子质量TAG、大分子质量TAG有关。随着温度升高，脂肪晶体在此过程中不断熔化、重结晶再熔化，TAG具有多种结晶构象或晶型，其中热稳定性较差的晶型首先在加热时熔化，剩余TAG将重新排列并重结晶成更稳定的晶型，在更高温度下熔化[25]。

此结晶-熔化DSC曲线对搅打稀奶油工艺配方设计具有重要的指导意义。通常，搅打稀奶油打发前在4～5 ℃冰箱中贮存，打发时从冰箱取出，在打发过程中，由于环境温度高于冰箱温度造成热传递和脂肪球碰撞造成摩擦生热，致使稀奶油温度会自然升温至10 ℃左右，所以若DSC曲线在5～10 ℃出现熔化峰，说明此温度范围内有相变潜热，搅打稀奶油为液油与固脂共存状态，利于稀奶油打发；若在15～30 ℃还有第2峰，说明此时又有另一个相变潜热发生，体系依然保持液油与固脂共存状态，使打发后的稀奶油裱花在此温度范围内贮存时，花纹既润泽又不塌陷，保持足够硬度和力挺性；反之，若20 ℃以上无峰，说明打发后的稀奶油裱花室温贮存时会发生稀塌变形。

2.4 乳脂肪及其分提组分特征晶型分析

TAG有3 种晶型：α、β’和β型，三者熔点及稳定性由低到高分别为α六方晶系（65 ℃）＜β’正交晶系（70 ℃）＜β三斜晶系（72 ℃）[26]。α晶型极不稳定，结晶初期易迅速转化成β’晶型，固液分离时不易过滤；β’晶型能形成精细的晶体网络包裹大量液态油，使稀奶油产品质地细腻，是最理想的晶型；而β晶型晶粒紧密粗大，包裹液油的能力较β’差，并会降低搅打稀奶油产品起泡性和打发性，产品表面粗糙起砂[27]。

XRD短间距反映脂肪的同质多晶型，4.15 Å附近的强衍射峰对应α晶型；3.8 Å和4.2 Å附近的强衍射峰对应β′晶型；4.6 Å附近的强衍射峰对应β晶型。而长间距反映晶体堆积方式的层间排列，对称型单不饱和TAG倾向于以3 倍链长（3L）结构堆积，其稳定晶型为两种β晶型（β2、β1）；三饱和TAG倾向于以二倍链长（2L）结构堆积，其稳定晶型主要为β′型[28]。为研究L20、L30、L40和S40脂肪同质多晶现象，对它们进行长间距和短间距XRD测定，结果见图4。

图4 乳脂肪及其分提组分XRD短间距（A）和长间距（B）Fig. 4 X-ray Diffractograms for short (A) and long (B) spacings of milk fat and its fractions

如图4A所示，在室温（25 ℃）条件下，过冷度较小导致L20呈液态油状无法结晶，因此无任何衍射峰出现。L30结晶程度较低，在3.81、4.24 Å只有十分微弱β’衍射峰，表明L30有微量β′晶型，这可能是因为液油含量高而干扰晶体衍射，微量α晶型短暂存在于L30体系中，随即变为β’。乳脂肪、L40、S40在3.81、4.12、4.24 Å处均有较强衍射峰，乳脂肪在4.58 Å处衍射峰微弱，说明乳脂肪含β晶型少，是以β′为主的α、β’混晶；L40和S40在4.58 Å处有强度较低的衍射峰，说明它们已发生由亚稳定β’转向稳定β，是以β’为主导的α、β’和β混晶，这与Sabariah等报道一致[29]。

乳脂肪衍射峰强度整体较S40、L40弱，说明乳脂肪同质多晶程度较S40、L40低。这种同质多晶转变与2.2节所述不同熔点TAG的迁移和聚集密切相关。结晶过程中，油脂体系自由度减小，油脂分子运动缓慢，形成稳定晶格需要一定时间，3 种晶型之间由α型向β型转化是一个ΔG小于0的自发趋势，受温度和结晶速率影响，只能加速或延缓而不能阻止该趋势发展。其中，α→β’转化迅速，而β’→β转化较为缓慢[30]。

由相同或相似FA碳链构成的TAG倾向形成2L结构，而不对称碳链的TAG倾向形成3L结构。在41 Å附近长间距衍射峰对应14 Å附近折射峰表示晶体结构以2L方式堆积，而61 Å长间距衍射峰对应31 Å附近折射峰表示其以3L方式堆积，此时因受仪器2θ角限制，61 Å附近衍射峰未测到[11]。

从图4B可以看出，各组分在长间距40.76 Å处均出现极强衍射峰，且在13.49 Å处出现对应折射峰，表明这些组分均有典型的2L结构。同时，仅乳脂肪、L40、S40在长间距29.44 Å处出现低强度折射峰，表明其晶体结构为2L和3L排布混晶，与L20、L30相比，高熔点组分L40、S40中TAG的层间包埋状态发生改变，这进一步说明TAG晶体尺寸及TAG分子链与基面的夹角发生了改变。由此可推断出随着分提温度升高，L40与S40的形成与其体系中高熔点TAG从2L的β′晶型向2L/3L链长排布的β’/β同质多晶转变密切相关。脂肪中3L SFA构成的TAG，尤其是StStSt的含量若高于2%，则高熔点脂肪晶体将导致产品口感粗糙；而长链单USFA和中链SFA构成的混合TAG不仅能赋予产品所需刚性结构，还能避免产品沙粒感[31-32]。TAG同质多晶现象受乳脂肪体系混乱度、冷却温度及速率、TAG中长链SFA含量及分布位置等受诸多因素影响，若添加部分乳化剂，作为“晶体结构改良剂”或“同质多晶转换抑制剂”在塑性脂肪中与TAG共晶，可阻止或抑制同质多晶现象发生[33]。

3 结 论

乳脂肪常用于黄油、稀奶油和干酪等高脂乳制品，对产品感官品质和质构特性产生重要影响，为了解乳脂肪及其各干法分提组分微观结构和宏观理化特性之间关系，本实验进行详细研究，发现影响乳脂肪理化性质的内因主要有FA、TAG结构组成及含量、热力学性质、晶体形态和同质多晶现象等。随着分提温度升高，高熔点组分中，长链SFA含量较高，而短、中链SFA和长链USFA含量较低，即对应高熔点TAG中，饱和TAG含量较高，不饱和及短链TAG含量低。而低熔点组分FA和TAG含量与之相反。高熔点组分DSC结晶和熔化温度较高，相变潜热大，相变峰出现位置是液油与固脂共存温度，在此温度下有利于搅打稀奶油打发和贮存。XRD研究表明，常温下高熔点组分是以β’晶型为主导的混晶，且为2L和3L混排，而低熔点组分常温下无结晶，仅有2L排布。综上所述，脂肪饱和程度越高，其熔点就越高，则生成的晶体稳定性越高硬度越大，结晶和熔化过程所需热焓也就越大，适于制备对硬度要求较高的产品。通过分析不同熔点组分乳脂肪的理化性质差异有助于更好地理解和控制乳脂肪及其下游衍生产品的理化特性，为乳制品原料油选择和新产品开发提供数据支持。