知母不同药用部位体外抗肿瘤、抗炎及抗氧化的作用研究＊

张亚楠，王 帅,2,3，包永睿,2,3，李天娇,2,3,刘金瑛，孟宪生,2,3＊＊

（1.辽宁中医药大学药学院 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心 大连 116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室 大连 116600；4.北京中医药大学 北京 100000）

知母为百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的干燥根茎，也称之为毛知母，最早记载于《神农本草经》，味甘、苦，性寒，入肺、胃、肾经，是最常用的清热泻火类中药之一[1-3]。具有清热泻火、滋阴润燥、止渴除烦、利大小便等功效[4-6]。《本草纲目》：知母（根）苦、寒，初步确定其药用部位。知母作为中医传统药物，以地下部位根入药，广泛用于治疗多种疾病，如温热病、高热烦渴、咳嗽气喘、便秘、虚烦不眠、消渴淋浊等症。现代研究发现知母含有多种化学成分，主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类、有机酸类等，具有抗菌抗炎[7,8]、抗氧化[9]、抗病毒、抗肿瘤[10,11]等多种药理作用，是现代医药研究中的热点药物之一。知母目前主要以其地下部位根入药，而产量较高的地上部位被废弃。但有关知母地上部分是否也具有较好药理活性的研究鲜有报道。因此，为了进一步挖掘知母的药用潜能，更好利用民间的传统药物资源，以减少资源的浪费，本研究以知母不同药用部位为研究对象，基于体外药用活性筛选和细胞模型，从其主要活性（抗肿瘤、抗氧化、抗炎）出发。探讨并比较知母不同药用部位活性差异，为知母作为一味传统的中药在现代医药方面的进一步应用和开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Agilent1100型快速高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；TTE20140709倒置相差显微镜（德国麦克奥迪公司）；SpectraMaxPlus384酶标仪（美国Molecular Drvices公司）。

1.2 材料与试剂

人胃癌HGC-27细胞株、人肝肿瘤HEPG-2细胞株、人结肠癌Caco-2细胞株、小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株（购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库）；知母植物全株（采自辽宁中医药大学本草园），经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为知母Anemarrhena asphodeloides Bge.；胎牛血清（美国Hyclone公司）；RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胰蛋白酶、双抗、MTT（美国GIBCO公司）；LPS（北京索莱宝生物科技有限公司）；Griess试剂（天津市科密欧化学试剂有限公司）；二苯基苦酰肼基（DPPH）、2，2′-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABST）、Vc（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.3 细胞培养

按常规细胞培养方法培养人胃癌HGC-27细胞株、人肝肿瘤HEPG-2细胞株、人结肠癌Caco-2细胞株、小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株（培养条件37℃，5%CO2），取对数生长期细胞进行实验。

1.4 供试品溶液的制备

将知母根、茎、叶、花各药材粉碎过4号筛（65目）备用，分别称取药材粉末5 g，置于圆底烧瓶中，以15倍量50%乙醇加热回流提取2次，每次1 h，合并滤液滤过，将滤液浓缩挥干去除溶剂，根据实验需要用不同培养液分别定容至5 mL（生药量0.1 g·mL-1），供体外细胞药效学实验检测用。按以上提取法制得知母根、茎、叶、花提取液，挥至5 mL（生药量0.1g·mL-1）过0.22 μm微孔滤膜，供HPLC检测用。

1.5 知母不同不同药用部位HPLC指纹图谱的建立

取1.4项下供试品溶液，按以下HPLC色谱条件：Agilent TC-C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱程序：0-55 min，5%-22%B；55-60 min，22%-100%B；流速：1 mL·min-1；进样量：5 mL；柱温：30℃；检测波长：256 nm，进行分析检测，得到知母药材不同药用部位的指纹图谱。

1.6 体外抗肿瘤药效学评价

采用MTT法，取处于对数生长期的人胃癌HGC-27细胞、人肝肿瘤HEPG-2细胞、人结肠癌Caco-2细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用含体积分数为10%胎牛血清的1640培养液、DMEM培养液稀释为5×10-4个·mL-1，以每孔100 μL的量分别接种于96孔板中继续培养，待细胞密度为80%左右弃掉上清液，分别给与0.1g·mL-1（生药）的知母根、茎、叶、花药液刺激人胃癌HGC-27细胞、人肝肿瘤HEPG-2细胞、人结肠癌Caco-2细胞24 h后，弃去上清液，每孔加入180 μL含体积分数为10%胎牛血清的1640培养液、DMEM培养液，再避光加入20 μL的MTT溶液，继续于培养箱中4 h。4 h后弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床震荡10 min后，用酶标仪492 nm波长下测定其吸光值A，计算细胞的增值抑制率[12]。

1.7 体外抗炎活性评价

1.7.1 LPS刺激巨噬细胞RAW264.7炎症细胞模型的建立

取处于对数生长期的巨噬细胞RAW264.7，用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用含体积分数为10%胎牛血清的1640培养液稀释为5×10-4个·mL-1，以每孔100 μL的量分别接种于96孔板中置于5%CO2，37℃的细胞培养箱中继续培养，待细胞密度为80%左右弃掉上清液，加入含2 μg·ml-1LPS的1640培养液100 μl·孔-1，LPS刺激终浓度为1 μg·mL-1，刺激24 h。

1.7.2 MTT法检测RAW264.7细胞的增殖活性

常规培养RAW264.7细胞，取处于对数生长期的巨噬细胞RAW264.7，用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用含体积分数为10%胎牛血清的1640培养液稀释为5×10-4个·mL-1，以每孔100 μL的量分别接种于96孔板中继续培养，待细胞密度为80%左右弃掉上清液，设置空白组与给药组。空白组：每孔加入100 μL 1640培养液；给药组：每孔加入100 μL不同浓度的知母根、茎、叶、花含药培养液（给药组浓度分别为：0.05、0.025、0.0125 g·mL-1生药量），设置5个复孔。继续培养24 h后，弃去上清液，每孔加入180 μL含体积分数为10%胎牛血清的1640培养液、DMEM培养液，再避光加入20 μL的MTT溶液，继续于培养箱中4 h。4 h后弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床震荡10 min后，用酶标仪492 nm波长下测定其吸光值A，计算细胞的增值率[（A加药组-A对照组）/A对照组×100%]。

图1 知母不同药用部位HPLC指纹图谱

表1 知母不同药用部位指纹图谱相似度结果

1.7.3 Griess法检测RAW264.7细胞分泌NO的水平

根据“1.7.1”所述建立的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，分别设置空白组、模型组、给药组。空白组：每孔加100 μL 1640培养液；模型组：每孔加100 μL浓度为1 μg·mL-1LPS；给药组：每孔加入100 μL不同浓度的知母根、茎、叶、花含药培养液（给药组浓度分别为：0.05、0.025、0.0125 g·mL-1生药量），设置5个复孔，在37℃、5%CO2条件下继续培养24 h后，取细胞上清液3000 r·min-1离心20 min。取上清100 μL按NO检测试剂盒流程操作，利用紫外分光光度计测定570 nm波长处的OD值，计算各组RAW264.7细胞分泌NO的含量。

1.8 体外抗氧化活性评价

1.8.1 DPPH自由基清除率的测定

参照文献[13,14]，以常用抗氧化剂Vc为阳性对照组，在96孔板中分别加入不同浓度的知母根、茎、叶、花无水乙醇稀释液（给药组浓度分别为：5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 mg·mL-1；阳性药Vc浓度：0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1）和100 μL DPPH（2 × 10-4 mol·L-1）自由基工作液，设置3个复孔。将96孔板放入酶标仪中振荡1 min后室温、避光静置30 min,在517 nm处测定吸光度A，计算各组自由基清除率，并计算IC50值。

Asample为供试品与DPPH反应后的吸光值；Ablank为供试品中未加DPPH反应液时的吸光值；Acontrol为溶剂与DPPH反应后的吸光值。

1.8.2 ABST自由基清除率的测定

参照文献[15,16]，将ABTS与K2S2O8分别配制成浓度为 7 mmol·L-1和 2.45 mmol·L-1的水溶液，并将两种溶液混合，室温避光放置12 h以上，得到ABTS储备液。使用时用PBS稀释使其在734 nm处的吸光度为0.78-0.82，-20℃保存待用。在96孔板中分别加入20 μL不同浓度的知母根、茎、叶、花无水乙醇稀释液（给药组浓度分别为：0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1；阳性药Vc浓度：0.050、0.075、0.100、0.150、0.200 mg·mL-1）和180 μL ABTS工作液，设置3个复孔。振荡混匀，室温条件下避光静置6 min后测定溶液在734 nm处的吸光值。计算各组的自由基清除率，并计算IC50值（ABTS自由基清除率的计算公式与DPPH法一致）。

2 结果

2.1 知母不同不同药用部位HPLC指纹图谱

经过HPLC分析检测，得到知母不同药用部位的指纹图谱如图1所示，根据色谱峰峰面积进行相似度分析，以S1批样品作为参照，进行多点校正，自动匹配，以中位数法生成共有模式图，各样品图谱（S1-S4）相对于对照图谱R的相似度结果（表1，2，3）。得到其结果（表1）。从图1指纹图谱中共有峰的峰面积及数量可以看出知母4个不同药用部位根、茎、叶、花的化学成分具有一定的差异性。知母根、茎、花的色谱峰较为单一，其中以知母茎的色谱峰数量和面积最为单一，知母叶的色谱峰最为丰富。从表1相似度结果数据我们不难发现：知母不同药用部位根（S1）、茎（S2）、叶（S3）、花（S4）各组分之间存在一定差异。其中与对照指纹图谱R相比较分为两类，其中S1、S3、S4为第一类，相似度均达到0.85以上；S2为第二类，相似度仅为0.15左右。

表2 知母不同药用部位对肿瘤细胞增值抑制作用的影响

2.2 知母不同药用部位体外抗肿瘤药效研究结果

如表2所示，知母不同药用部位作用于人胃癌HGC-27细胞株、人肝肿瘤HEPG-2细胞株、人结肠癌Caco-2细胞株24 h后呈现出不同程度的增值抑制作用。知母茎对人胃癌HGC-27细胞株、人肝肿瘤HEPG-2细胞株、人结肠癌Caco-2细胞株无抑制作用；知母根、叶、花对人胃癌HGC-27细胞株、人肝肿瘤HEPG-2细胞株、人结肠癌Caco-2细胞株具有不同程度的抑制作用。

2.3 知母不同药用部位体外抗炎活性研究结果

本实验研究结果显示，与空白组相比，知母不同药用部位在所选定的浓度范围内（0.0125、0.0250、0.0500g·mL-1生药量）对Raw 264.7细胞活力无显著影响（表3），说明药物在选定的浓度范围内对Raw 264.7细胞无毒性作用。

由表3可知，细胞培养24 h后，与空白组相比，LPS组均能够很强的刺激巨噬细胞Raw 264.7释放NO，差异有统计学意义（P＜0.01），提示炎症细胞模型建模成功；给与不同浓度的知母不同药用部位治疗24 h后，与LPS组相比，均能减少NO的释放，并且呈剂量依赖性关系，知母茎对减少NO释放的效果最为显著。

表3 知母不同药用部位提取物对Raw 264.7细胞活力的影响

表4 知母不同药用部位提取物Raw 264.7细胞分泌NO的影响

2.4 知母不同药用部位体外抗氧化活性研究结果

本实验研究结果显示，知母不同药用部位均具有较强的清除DPPH与ABST的能力（表4），其中知母不同药用部位中，知母花对DPPH和ABST的清除能力最强（DPPH：IC50=4.171 mg·mL-1；ABST：IC50=0.375 mg·mL-1）（P ＜ 0.05），其次分别为知母叶、茎、根。

表5 知母不同药用部位体外抗氧化活性

3 讨论

知母作为一味广泛使用的传统中药，其在我国野生以及人工种植的面积广泛，资源丰富[17]。知母以地下部位根入药，而产量较高的地上部分被废弃，造成知母资源的浪费、品种单一的问题[18]。为了加强中药在临床的治疗效果，合理利用天然药用资源，精准用药，对于药物的不同药用部位要针对不同的疾病合理用药。本研究以知母根、茎、叶及花为研究对象，对其不同药用部位HPLC指纹图谱进行初步研究，并进行相似度评价，进一步对知母不同药用部位体外抗肿瘤、抗炎、抗氧化活性进行研究。

中药的化学成分复杂，而其复杂的化学成分同时造成了不同的药效作用，不同的药效与不同的化学成分是协同作用的关系[19]。本研究基于HPLC法对知母不同药用部位指纹图谱初步研究并进行相似度评价，结果显示知母根、茎、花的色谱峰较为单一，其中以知母茎的色谱峰数量和面积最为单一，知母叶的色谱峰最为丰富。同时知母不同药用部位之间也存在一定的相似性，与对照指纹图谱相比，知母根、叶、花为一类。知母茎为一类。综上可知知母不同药用部位根、茎、叶、花的化学成分具有一定的差异性。

本研究对知母不同药用部位体外抗肿瘤、抗炎、抗氧化活性进行研究，结果显示知母不同药用部位对人胃癌HGC-27细胞株、人肝肿瘤HEPG-2细胞株、人结肠癌Caco-2细胞株24 h后呈现出不同程度的增值抑制作用，其中知母茎对三种肿瘤细胞无抑制作用；知母根、叶、花对三种肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用。巨噬细胞在抗炎活性研究中及其重要，其主要作用在于刺激其分泌炎性介质，而LPS是诱导炎症因子分泌的最有效的刺激物，通过减少巨噬细胞分泌炎症因子是分析检测药物抗炎效果的一个重要途径[20]，NO是刺激巨噬细胞分泌的一种重要的炎症介质[21]，炎症因子的分泌与肿瘤、高血压、高血脂等疾病具有重要的关联[22]。本研究结果得到知母不同药用部位对LPS诱导的Raw 264.7细胞释放的炎症因子NO均有明显的抑制作用，说明知母具有明显的抗炎作用，其中知母茎抗炎活性最强，是潜在的最有效的抗炎活性部位，其余抗炎效果强弱依次为知母花、叶、根。

相关研究表明多种疾病与自由基密切相关，人体表现出的癌症、炎症等多种症状均与体内细胞产生的自由基不平衡有关，如高脂血症血管内膜的损伤以及脑中生物分子的氧化损伤、肿瘤中DNA受到氧化损伤等多种疾病与自由基密切相关[23,24]，因此开发具有抗氧化活性的天然植物具有重要意义。本研究结果显示知母不同药用部位均显示出不同程度的抗氧化作用，其中知母花对DPPH和ABST的清除能力最强，其次分别为知母叶、茎、根，这为今后天然抗氧化剂的研发提供重要的应用前景。

综上所述，研究表明知母不同药用部位化学成分有一定的差异性，本实验研究结果显示知母不同药用部位体外抗肿瘤、抗炎、抗氧化作用的强弱具有一定的差异性，为了更好的发挥药效，在临床上对于不同疾病的治疗在用药部位上应该精准选择。因此，本研究结果对知母进一步的开发和应用以及其不同药用部位资源的扩展及其合理应用具有重要的参考价值。