壳聚糖抑菌性能的研究进展*

柯松 王敏*徐源 王文凯 刘载阳

目前的大多数研究均表明，壳聚糖对多种微生物包括细菌、真菌等都具有抑制效果[1]。本文主要综述壳聚糖对细菌和真菌抑制效果的研究进展。壳聚糖的抑菌性能影响因素众多且复杂，目前已研究的影响因素主要有分子量、浓度、脱乙酰度、pH 值、金属离子、菌株、晶型等[2]，多种因素之间又有相互交错作用，使得目前对壳聚糖抑菌性影响因素的评价试验较为困难。本文将从抑菌性影响因素及其抑菌机制等方面进行总结，探讨近年来的研究结果，为更深入、细致了解壳聚糖抑菌性能提供理论基础及科学参考。

1 壳聚糖的抑菌性能特点

1.1 不同分子量壳聚糖的抑菌性能

分子量是壳聚糖抑菌性的重要影响因素，也是目前壳聚糖抑菌性研究的热点。但是关于分子量与抑菌性的定量规律尚不明确。宋献周等[3]研究了几种不同分子量的-壳聚糖（平均分子量分别为 MW=1.56×104，3.3×104，9.5×104，7.2×105）对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等细菌的抑菌性，实验以绘制细菌生长曲线表示抑菌性，结果显示低分子量的-壳聚糖具有更慢的细菌生长曲线，从而认为低分子量的-壳聚糖具有更好的抑菌效果。然而，Younsook 等[4]的研究却发现高分子量的壳聚糖溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果要高于低分子量壳聚糖溶液，并且认为在分子量小于30×104Da 时，壳聚糖溶液对金黄色葡萄球菌的抑制效果随分子量减少而逐渐减弱。郑连英等[5]对于大肠杆菌抑菌规律的研究与宋献周等[3]相似，由表1 可以看出，分子量越低，抑菌性越强；但表2 中显示，对于金黄色葡萄球菌，当分子量为30 万以下时，随着分子量降低，抑菌性减弱。

表1 壳聚糖对E.coli 的抗菌能力（%）

表2 壳聚糖对St.aureus 的抗菌能力（%）

他们研究壳聚糖分子量对抑菌性影响在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中得出不同的结论，提示菌种也是不可忽视的重要影响因素。也有人认为，造成不同分子量抑菌效果研究结果混乱的另一原因是没有对壳聚糖分子量大小进行统一标准的划分。目前壳聚糖分子量高低没有具体标准，普遍认为低分子量为分子量＜50 kDa；中等分子量为50 kDa～150 kDa；高分子量为分子量＞150 kDa[6]。

1.2 不同浓度壳聚糖的抑菌性能

很多研究都表明，壳聚糖溶液浓度与其抑菌性能大致成正相关性。谢勇等[7]的研究表明，在同等酸性条件下，pH值为6.5 和5.5 时，当壳聚糖的浓度从1.5%增加到4%时，壳聚糖对幽门螺杆菌抑菌作用增强，但是当浓度达到4%以后，抑菌作用不再增强。杨声等[8]的研究控制壳聚糖分子量为5×104，随着浓度增加，抑菌圈直径越大，表明抑菌效果越明显；但当浓度达到1.5%时，变化不再明显，此即为最佳抑菌浓度。相关机制研究认为随着壳聚糖浓度的增大，溶液中—NH2的浓度增加，而壳聚糖发挥抑菌效果需要在酸性溶液中。当在酸性溶液中，—NH2易与H+结合形成NH4+，而NH4+的增多，对于细菌（带负电荷）的静电吸引力增强，使更多的细菌被絮凝、聚沉，从而抑制了细菌的生长繁殖，增强了抑菌效果[9]。

1.3 不同脱乙酰度（或乙酰度）壳聚糖的抑菌性能

分子量和脱乙酰度是影响壳聚糖抑菌性的两种独立因素，且有研究表明分子量对壳聚糖抑菌性的影响要大于脱乙酰度的影响[10]。目前普遍的研究结论是脱乙酰度越高，壳聚糖抑菌性越高[6]。Suzuki K 等[11]研究认为乙酰基的数目和位置对多糖的活性影响较大。故也有从改变脱乙酰度的角度来改变壳聚糖活性的相关研究。王鸿等[12]研究了分子量较大的壳聚糖（9.3×105～9.8×105）中3 种不同脱乙酰度壳聚糖（DD=81.8%，78.4%，61.3%）的抑菌性，他们研究的对象为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。用显微镜计数细菌在3种不同脱乙酰度壳聚糖溶液的液体蛋白胨培养基的生长量来表示抑菌性，其研究结果显示，当控制壳聚糖溶液均为浓度0.2%，pH 值6.0 时，不同脱乙酰度壳聚糖溶液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均相对对照组有抑菌性，且随脱乙酰度增加抑菌性增大。冯小强等[13]研究结果得出相似的规律，并且分析其可能机制为：壳聚糖的脱乙酰化为其分子链上的亲脂性基团—NHCOCH3被亲水性基团—NH2取代的过程；因此脱乙酰度的增大，使得壳聚糖溶液中—NH2增多，抑菌效果增强。

1.4 不同pH 值壳聚糖的抑菌性能

壳聚糖只有在酸性溶液中才具有抑菌性，并且溶液的pH 值越低，抑菌活性越强[14]。荆迎军等[15]的研究也证实，壳聚糖的抑菌活性随pH 值的降低（从6.0 降低到4.0）而增高，并且通过多因素方差分析认为pH 值是一个极显著的影响因素。这可能是因为在较低的pH 值情况下，更多的氨基带正电荷，使其与带负电荷的细菌表面相互作用增强。然而大多数研究都忽略了一个事实，酸性溶液本身就具有抑菌效果，因此最终的实际抑菌效果可能是酸性溶液中的H+和壳聚糖中的—NH2基团共同作用的结果[16]。针对这一疑问，Jung J 等[17]进行了进一步研究，他们通过对比乙酸、乳酸、盐酸以及酸溶解壳聚糖对大肠杆菌的抑制效果。其结果表明酸溶解壳聚糖溶液相对于等量的酸溶液来说具有更强的抑菌效果，这种额外抑菌率最高可增达65%。因此表明，壳聚糖的部分抑菌效果是因为溶液中的酸性成分或者其他活性碎片产生的。

1.5 不同菌株对壳聚糖抑菌性能的影响

荆迎军等[15]的方差分析认为，虽然壳聚糖的分子量、pH 值等因素都是壳聚糖抑菌活性的极显著影响因素，但菌株本身才是壳聚糖抑菌活性大小的关键因素。在多项研究中都表明壳聚糖对于革兰氏阳性菌的抑菌效果相对于革兰氏阴性菌更强[18-21]。胡瑛等[22]也研究了不同分子量的壳聚糖对6种测试菌（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、棒状杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌）的最低抑菌浓度MIC 值。其研究中，分子量为8.7 万的壳聚糖对金黄色葡萄球菌的MIC为0.05%，对大肠杆菌的MIC 为0.1%。也同样说明，壳聚糖对革兰氏阳性菌的抑菌性比对革兰氏阴性菌更为敏感。

1.6 金属离子对壳聚糖抑菌性的影响

荆迎军等[15]研究了金属离子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Li+）对壳聚糖抑菌性的影响，认为金属离子可显著降低壳聚糖的抑菌活性，并且对革兰氏阴性菌的影响大于革兰氏阳性菌，他的研究认为Ca2+、Mg2+的影响最大，显著降低了壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑菌性。当金属离子到达一定浓度时，壳聚糖会完全失去抑菌活性。陈威等[23]在壳聚糖溶液加入不同浓度金属离子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+）后，壳聚糖溶液的抑菌效果明显受到影响，当金属离子浓度达到一定程度时，壳聚糖完全失去抑菌活性。Bingjun Q 等[24]也研究金属离子对壳聚糖溶液抑菌效果的影响，他们的实验研究认为当加入Co2+和Ni2+时则可以显著增加壳聚糖的抑菌活性，而加入K+、Na+、Li+则显著削弱壳聚糖的抑菌活性。

1.7 改性壳聚糖的抑菌性能

尽管壳聚糖的抑菌性能已被大多实验证实，但原生壳聚糖分子量大，只能溶解于一些酸性溶液中，不能直接溶于水。这在一定程度上限制了壳聚糖抑菌性的应用。因此近年来，对壳聚糖改性，尤其以增加其水溶性成为研究壳聚糖抑菌性能的热点。水溶性壳聚糖在溶液中可以分离形式存在，拥有延长构象，能够使反应更加充分[25]，从而可以更高效地抑制细菌生长。如何增加水溶性是壳聚糖发挥抑菌效果的关键。水溶性壳聚糖衍生物可以通过在多聚链上引进持久的正电荷获得。也有研究者通过降低壳聚糖颗粒的尺寸，使其微粒化，从而改善其抑菌效果[26-28]。

2 壳聚糖的抑菌机制

近年来，随着研究的深入，人们对于壳聚糖抑菌机制已经有了较为深刻的认识，但就其确切抑菌机制至今来说还尚不十分明确。目前普遍认可的壳聚糖抑菌机制有3 种说法：壳聚糖中的NH4+与带负电的细菌细胞膜反应，从而改变细胞膜通透性，导致细胞外的营养成分无法向细胞内运输[29]；或者是因为细胞膜通透性改变导致细胞的内容物（例如钾离子以及其他低分子量的蛋白质）渗出致裂解死亡。壳聚糖进入细菌细胞内，与细胞内带负电的物质（主要是蛋白质和核酸）结合，使细胞的正常生理功能（例如DNA 的复制和蛋白质的合成等）受到影响，抑制细菌的繁殖，导致微生物的死亡。壳聚糖作为一种螯合剂，选择性地螯合对微生物生长起关键作用的金属离子，从而抑制微生物的生长和产毒[30]。但是目前关于不同分子量的壳聚糖抑菌性的研究有很多不一致的观点，甚至相反的结论。许多学者认为可能是高分子量壳聚糖和低分子量壳聚糖存在不同的抑菌机制；也有人认为可能是壳聚糖对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌机制存在不同。各种机制的相互交错影响使得目前研究壳聚糖抑菌性及抑菌机理显得不甚清晰。了解清楚壳聚糖的抑菌机制，将有助于在将来的研究中更加具体地把控壳聚糖的抑菌性。以下将从分子量和菌种两个角度概括目前对壳聚糖抑菌机制的认识研究。

2.1 壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑菌机制

Helander 等[31]抑菌机制的研究认为壳聚糖破坏了革兰氏阴性菌的外膜结构。李晓芳等[32]以大肠杆菌作为代表，考察了壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑菌性。通过测定菌液中加入疏水性荧光探剂后荧光强度的改变，考察了壳聚糖对外膜渗透性的影响。其研究结果表明：因为革兰氏阴性菌表面的负电荷，壳聚糖可与其细胞膜发生静电作用，增加细胞膜的渗透性，而使细胞膜破坏，导致菌体死亡。然而也有人认为对于革兰氏阴性菌的抑菌机制是壳聚糖主要通过渗透到细菌体内，吸附阴离子物质从而干扰细胞代谢[33]。

2.2 壳聚糖对革兰氏阳性菌的抑菌机制

革兰氏阳性菌细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构，特点是厚度大。有研究认为壳聚糖对于革兰氏阳性菌的抑菌机制主要是在菌体表面形成致密的外膜，抑制细胞膜的通透性，从而阻止营养物质进入细胞内来达到抑菌目的。因此随着壳聚糖分子量的增加，其对革兰氏阳性菌的作用是逐渐增强的。郑连英等[34]的研究应证了这一规律。

2.3 高分子量壳聚糖的抑菌机制

陈威等[23]研究了两种不同分子量（5 kDa 和50 kDa）壳聚糖引起金黄色葡萄球菌钾离子及ATP 渗漏的情况，其结果显示分子量为50 kDa、浓度为1%的壳聚糖引起金黄色葡萄球菌和白色念珠菌钾离子渗漏量较分子量为5 kDa，浓度为1%的壳聚糖溶液引起钾离子的渗漏量多，并且两者均较对照组浓度为0.5%的乙酸溶液引起钾离子的渗漏量多，ATP 的渗漏情况与上述钾离子的渗漏情况类似。而现有的大多数研究均表明低分子量的壳聚糖具有更好的抑菌效果。因此推测了高分子量的壳聚糖溶液可能是通过破坏细胞膜结构来抑制细菌生长的。而低分子量壳聚糖很可能存在与高分子量壳聚糖不同的抑菌机制。

2.4 低分子量壳聚糖的抑菌机制

Xiao 等[35]的研究中用FITC（异硫氰酸荧光素）标记低分子量壳聚糖，并与大肠杆菌一起培养。经过荧光检测显示，在大肠杆菌的细胞体内存在大量被标记的分子量为8 000 U和4 000 U 的壳聚糖。其推测可能是由于低分子量的壳聚糖通过渗透的方式进入细胞体内。带有正电荷的壳聚糖与带有负电荷的DNA 发生相互作用，从而影响了RNA 转录和蛋白质合成，从而实现了抑菌。

3 讨论

本文回顾了壳聚糖抑菌性的研究进展。普遍认为壳聚糖具有良好的抑菌活性，可有效地抑制细菌生长，而且抑菌活性高，抗菌谱广。但国内外学者对其抑菌性能的影响因素存在许多不一致观点，甚至不同的研究得出完全相反的结论，很大程度上限制了壳聚糖的应用。其主要争论在以下几点：分子量对壳聚糖抑菌性定量规律。目前普遍认为分子量相对低的壳聚糖有更好的抑菌效果，但是对具体多低分子量的壳聚糖具有较好的抑菌效果尚未定论。目前对高分子量的壳聚糖抑菌试验得出研究结论尚无法一致。分析认为，多数试验均采用不同平均分子量壳聚糖作为研究对象，但是在相近的平均分子量壳聚糖中高分子量壳聚糖和低分子量壳聚糖的比例可以完全不相同。因此，即使完全一样的平均分子量壳聚糖在相同实验条件下也可能得出不同的实验结果。平均分子量壳聚糖掩盖了高分子量壳聚糖和低分子量壳聚糖的比例关系，导致对不同分子量壳聚糖抑菌性研究相对困难。在今后的研究中，可以尝试对高分子量壳聚糖和低分子量壳聚糖进行筛选后分别研究。随着壳聚糖浓度增加，其抑菌性也增强，但抑菌效果不会随着浓度增大而无限增强。普遍认为，壳聚糖在特定分子量、特定pH 时，针对某种菌时会有最适抑菌浓度，超过该浓度，壳聚糖的抑菌效果将不会增强，甚至可能下降。对于壳聚糖溶液抑菌性能的应用应该注意到此规律。并期待今后的研究中对最适抑菌浓度的相关研究能够更深入。而脱乙酰度、pH 值、金属离子等对壳聚糖抑菌性的影响，结论较为一致。在研究中可作为相对固定的控制变量，会使壳聚糖抑菌规律分析更加容易。不同分子量壳聚糖、壳聚糖对不同菌种之间可能存在不同的抑菌机制。但目前的研究多是假设及推论，下一步对壳聚糖抑菌机制的研究仍然是其抑菌性能研究中的热点，如果可以利用分子生物学方法从基因层面去研究其抑菌性，将会对了解壳聚糖抑菌特点及更好应用壳聚糖具有更大帮助。