基于雌激素代谢调控的白藜芦醇对MNNG诱导子宫内膜癌变的抑制作用

尹 弟，陈春霞，闵梦君，赵 峰，杜 蕾，印晓星，周雪妍

(徐州医科大学药学院，江苏省新药研究与临床药学重点实验室，江苏 徐州 221004)

子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)是最常见的妇科肿瘤之一，近年来，EC的发病率逐年增加，而且发病年龄愈发年轻化[1]。虽然手术结合放疗和化疗可以达到良好的治疗效果，但是术后生育功能的丧失，以及化疗药物毒性大、副作用强、易产生耐药性，对EC患者的身心健康构成严重威胁[2]。目前，EC的诊断尚缺乏金标准。因此，临床上迫切需要早期准确的EC诊断方法。

EC的发生发展与体内雌激素水平密切相关[3]。雌激素活性物质包括雌酮(estrone，E1)、雌二醇(estradiol，E2)、雌三醇(estriol，E3)、2-羟基雌酮/雌二醇(2-hydroxyestrone/estradiol，2-OHE1/E2)、4-羟基雌酮/雌二醇(4-hydroxyestrone/estradiol，4-OHE1/E2)、16α-羟基雌酮(16α-hydroxyestrone，16α-OHE1)、2-甲氧基雌酮/雌二醇(2-methoxyestrone/estradiol，2-MeOE1/E2)和4-甲氧基雌酮/雌二醇(4-methoxy-estrone/estradiol，4-MeOE1/E2)。超生理浓度的雌激素可与雌激素受体结合，介导多种生长因子的过表达，促进细胞的生长和增殖[4]。而雌激素的多种代谢产物则可与DNA形成加合物，诱导基因突变，产生直接的基因毒性。尤其是2-OHE2和4-OHE2具有极强的致癌活性，它们在体内通过非受体介导，与DNA形成加和物，导致DNA编码错误，诱导DNA损伤，促进癌症形成[5]。因此，雌激素及其毒性代谢产物异常蓄积，是EC发生发展的重要危险因素。

白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种植物多酚，具有抗氧化、抗肿瘤效应[6]。研究发现，Res可以抑制成年乳腺癌♀鼠的肿瘤发生，但对于青春期前的未成年♀鼠，Res则延长了实验动物的动情期时间，并增加了乳腺癌的发病率和平均瘤重[7]。因此，Res对肿瘤的调控作用与实验对象体内雌激素水平密切相关。本实验以ICR ♀小鼠为研究对象，通过宫腔注射N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl- N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)建立小鼠EC模型，同时给予Res进行治疗，考察Res对雌激素内稳态的调控及EC的治疗作用，为探寻EC临床诊断潜在生物标志物与EC的临床药物治疗方案提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级ICR小鼠，♀，体质量(16～20) g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。饲养于徐州医科大学新药与临床药学重点实验室清洁级动物实验室，许可证号：SCXK(沪)2013-0016，室温(25±2)℃，相对湿度(55±5)%，光暗周期12 h/12 h。实验期间各组小鼠给予自由饮水。

1.2 试剂MNNG(货号R-081N)、Res(货号M02442)，购自北京百灵威科技有限公司；苏木素伊红(HE)染色试剂盒(C0105)，购自碧云天生物技术研究所；TRNAiso Plus(货号9108)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(货号RR820A)、PrimeScript RT reagent Kit(货号RR037A)，购自宝生物工程(大连)有限公司；雌二醇(货号E8875)、雌酮(货号1238002)，购自美国Sigma Aldrich公司；2-甲氧基雌二醇(货号E2490-000)、4-羟基雌二醇(货号E2500-000)、2-羟基雌二醇(货号E2470-000)、16α-羟基雌酮(货号E1250-000)，购自加拿大Steraloids公司；4-甲氧基雌二醇(货号M262630)、2-羟基雌酮(货号H941945)、4-羟基雌酮(货号H941950)、2-甲氧基雌酮(货号M262520)、4-甲氧基雌酮(货号M226135)，购自北京百灵威科技有限公司；d5-雌二醇(货号D-5552)，购自美国C/D/N同位素公司。

1.3 仪器KD-TS3A生物组织自动脱水机、KD-BM生物组织石蜡包埋机(金华科迪仪器设备有限公司)；RM2235轮转式切片机、HI1210病理组织漂烘机(德国Leica公司)；Tecnai G2透射电子显微镜(美国FEI公司)；NanoDrop 1000核酸浓度测定仪(美国Thermo Scientific公司)；2720 PCR仪(美国ABI公司)；Light Cycle 480实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 6420A三重四级杆质谱仪、MassHunter Acquisition数据采集软件、MassHunter Qualitative定性分析软件和MassHunter Quantitative定量分析软件(美国Agilent公司)。

1.4 EC小鼠模型的建立♀ ICR小鼠(4～5周龄)，适应1周后，将小鼠随机分为4组，每组10只：正常对照组(Control组)、Res组、模型组(MNNG组)、模型+Res给药组(MNNG+Res组)。其中，MNNG组和MNNG+Res组宫腔给予MNNG(溶于50%聚乙二醇中，单次给药60 mg·kg-1)，1周1次，连续3周。对照组及Res组宫腔给予50%聚乙二醇进行假手术(给药体积及次数同模型组)。第1次造模后，对照组及MNNG组给予空白纯化日粮配方饲料饲养；Res组及MNNG+Res组给予含有Res(800 mg·kg-1)的纯化日粮配方饲料饲养。具体的做法为：每天每10只小鼠给予50 g含药饲料，每天上午8 ∶00定时更换，且将前1 d剩余的饲料倒掉，含药饲料密闭储存于4 ℃，避光保存。连续喂养36周后，处死小鼠并取血清、子宫组织备测。

1.5 HE染色取子宫组织，依次行4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片处理后，进行脱蜡、染色、脱水、封片，晾干后，通过显微镜观察子宫组织形态结构的改变。

1.6 qPCR检测使用TRIzol提取子宫组织总RNA，按照PrimeScript RT试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。然后进行定量逆转录酶PCR分析，使用Roche LightCycle 480软件计算得出样本中各目的基因的Ct值，通过ΔΔCt法计算各目的基因的mRNA相对表达水平，以GADPH的mRNA表达水平作参比。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，序列见Tab 1。

1.7 雌激素及其代谢产物的含量测定取小鼠子宫适量，精密称重，按100 g·L-1的比例加入PBS缓冲液，在冰水浴中充分匀浆，制备成100 g·L-1的组织匀浆液。取匀浆液或小鼠血清300 μL,加入10 μL d5-E2溶液(50 nmol·L-1)作为内标，涡旋1 min后，按照1 ∶3(V∶V)的体积加入乙酸乙酯，涡旋10 min，于4 ℃、13 000 r·min-1离心5 min，收集上层有机相，有机相于40 ℃真空冷冻干燥机旋转干燥后，精密加入0.1 mol·L-1的Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液(pH 9.0)50 μL和1 g·L-1的丹磺酰氯丙酮溶液50 μL，充分涡旋混合1 min，65 ℃烘箱加热反应7 min，放冷后，4 ℃、13 000 r·min-1离心15 min，转移上清液入进样瓶中。用LC-MS/MS法测定样本中雌激素及其代谢产物共11种目标分析物的含量，检测方法应用本课题组前期建立并验证的液质联用方法检测[8]；定量方法采用加内标的标准工作曲线法。

Tab 1 qPCR reaction primers and amplification length

2 结果

2.1 Res对EC发生发展的抑制作用Fig 1A结果显示，MNNG组小鼠的体质量呈逐渐增加的趋势，于第4周和第8周体质量明显高于对照组(P<0.05)；MNNG+Res组小鼠体质量均较MNNG组小鼠低，且于16～36周体质量明显低于MNNG组(P<0.01)。同时子宫指数结果显示，MNNG组小鼠子宫指数比对照组高，且差异有统计学意义(P<0.05)。给予Res治疗后，MNNG+Res组小鼠子宫指数有所减小，且差异有统计学意义(P<0.05)，见Fig 1B。qPCR方法检测各肿瘤标志物的mRNA表达水平(Fig 1C)，与对照组相比，模型组中Ccnd1、Erbb2的mRNA表达明显升高(P<0.01)，且给予Res治疗后，其表达明显降低(P<0.01)；CK-19在模型组和正常对照组之间无统计学差异，但其在MNNG+Res组的表达明显降低(P<0.01)。小鼠子宫组织HE染色结果显示(Fig 1D)，对照组和Res组小鼠子宫内膜腺体排列规则，结构良好；而MNNG诱导的EC小鼠的HE染色结果显示子宫内膜腺体结构复杂、排列紧密，部分间质消失，腺腔可见分支形成，局灶可见筛孔；给予Res治疗后，小鼠子宫肌层轻度水肿，子宫内膜较模型组趋于正常状态。

2.2 Res对雌激素内稳态的调控作用采用LC-MS/MS定量分析方法检测小鼠血清和子宫组织中雌激素及其代谢产物的含量，并将数据采用SIMCA 14.0软件进行OPLS-DA统计分析。采用VIP来衡量预测各个代谢物对模型的贡献，通常VIP>1为潜在生物标志物的评判标准。同时需要进一步通过t检验方法，保留具有统计学差异的数据。

对模型分离贡献作用较大且差异具有统计学意义的代谢物有：血清中，4-MeOE1、E1；子宫中，4-OHE2、2-MeOE1，表明这几个代谢物可能是Res抗肿瘤作用的潜在生物标志物。

对上述代谢物分别进行含量测定，Tab 2结果显示，在EC小鼠血清及子宫内膜组织中，具有细胞保护效应的2-MeOE2、4-MeOE1含量明显降低，具有基因毒性作用的4-OHE2含量明显升高，而给予Res治疗后可恢复其稳态平衡。提示Res可能通过调控雌激素内稳态，发挥其对EC的抑制作用。

3 讨论

EC是最常见的妇科恶性肿瘤，在我国，随着社会发展和经济条件改善，EC的发病率逐年升高，目前仅次于宫颈癌，居女性生殖系统恶性肿瘤的第2位。初潮年龄早及晚绝经、多囊卵巢综合征、外源性雌激素作用、子宫内膜癌三联征(肥胖-高血压-糖尿病)、乳腺癌、卵巢癌家族史等，均为EC的高危因素，严重危害着女性的生命健康。虽然手术联合放化疗的治疗方案可取得良好的治疗效果，但是，术后生育功能的丧失以及保守治疗所带来的复发风险仍给EC患者的生理、心理健康带来了严重的威胁[2]。

Fig 1 Inhibition of resveratrol on endometrial cancer model

A:Body weight curves were plotted for each treatment group; B: Mice uterus index; C:The mRNA expression of Ccnd1, Erbb2 and CK-19 was detected in uterus tissues; D:HE staining of uterus tissue for the appearance and structure of the tumor ×40.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMNNG group.

Tab 2 Concentration of potential biomarkers in serum and uterine tissue of

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMNNG

Fig 2 OPLS-DA score plots of serum(A, C) and uterus tissue(B, D) estrogen metabolites in mice

Fig 3 Variable importance in projection(VIP) values calculated from OPLS-DA models for estrogen metabolic profile data in mouse serum(A, C) and uterus tissue(B, D)

毫无疑问，EC若能尽早被发现并对其加以控制，病情将得到改善或逆转；而若在临床早期不对其加以控制，病情发展将难以控制。但事实上，EC的临床诊断尚缺乏金标准，早期EC的诊断还比较困难，需要仔细询问病史，准确细致地进行妇科检查，并采用辅助检查，才能进一步作出诊断。目前，临床上对EC的诊断方法主要还是通过诊断性刮宫及分段诊刮[9]，但是，诊刮不能判断是否有肌层的浸润及浸润的深度，是否有淋巴结转移情况，故无法进行术前准确分期，不能达到早期、准确诊断EC的要求。因此，寻找有预测价值的EC生物标志物具有极其重要的临床意义。本实验通过LC-MS/MS定量分析方法，测定EC小鼠血清和子宫组织样本中雌激素及其代谢产物的含量变化，旨在探明可用于EC临床诊断的潜在生物标志物。

多项研究表明，雌激素代谢紊乱与妇科肿瘤疾病密切相关。雌激素类物质可在体内多种代谢酶的介导下进行动态的生物转化，而雌激素及其毒性代谢产物组成的活性物质组则根据其结构的不同、浓度水平的差异，以不同的分子机制在EC的发生、发展过程中发挥着重要的作用。内源性雌激素主要包括E1、E2和E3，由于体内E3的含量极低，故雌激素的代谢研究主要还是考察E1和E2的代谢情况。雌激素的代谢方式包括氧化代谢与结合代谢(O-甲基化、葡萄糖醛酸化及磺化等)两种。氧化代谢主要为羟基化过程，主要产物为4-OHE2、2-OHE2、4-OHE1、2-OHE1和16α-OHE1。雌激素的代谢紊乱被认为与妇科肿瘤相关是因为有证据表明，其可以引起DNA损伤和突变，其中雌激素的羟基化代谢起了主要作用，在雌激素的羟基化代谢产物中，4-OHE2是活性最强的一种[10]。雌激素的另一类代谢产物是由羟基化代谢产物被儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)甲基化生成的甲氧基类雌激素(2-MeOE2、4-MeOE2、2-MeOE1、4-MeOE1)，这类雌激素表现为保护效应，且有研究表明，2-MeOE2可明显抑制6T-CEM细胞增殖，促进细胞凋亡[5-6,11]。

Res具有抗癌、抗突变、抗炎、诱导细胞凋亡及雌激素调节等多方面的药理活性。Res可作用于在肿瘤的起始、促进、发展3个阶段：① 通过抗突变、诱导二相药代酶的作用，发挥抗肿瘤起始活性[12]；② 通过抗炎、抑制环加氧酶和氢过氧化物酶的活性，在肿瘤的促进阶段起抑制作用[13]；③ 诱导人早幼粒白血病细胞的分化而抑制肿瘤的发展[14]。Banerjee等[15]利用EC细胞系进行体外实验发现，Res可对EC细胞发挥很好的生长抑制作用，并且能最大限度地抑制E2介导的ER阳性乳腺癌MCF-7细胞生长刺激效应。且Res是一种多酚类化合物，因其分子结构与合成的雌激素类化合物己烯雌酚的结构类似，并显示一定的雌激素样活性，被称为植物雌激素。因此，Res可能通过调控雌激素水平，进而抑制EC的发生、发展。

目前，EC模型可分为大鼠自发子宫内膜腺癌、雌激素诱导子宫内膜癌、MNNG诱导子宫内膜癌、肿瘤细胞接种诱导裸鼠子宫内膜癌、Pten基因突变诱导的子宫内膜癌模型。在本实验中，采用MNNG诱导的小鼠EC对各种激素敏感，且造模方法简单，造模成本相对较低，重复性强。HE染色结果显示，MNNG组小鼠腺体结构复杂、排列紧密，部分间质消失，腺腔可见分支形成，局灶可见筛孔，表明EC模型是成功的。qPCR实验检测小鼠子宫组织中肿瘤标志物的表达，对EC模型进行了验证。在MNNG+Res组中，给予Res治疗后，小鼠子宫内膜的形态发生了改变，内膜增生得到了改善，且肿瘤标志物的表达也明显降低，表明Res对EC产生了一定的抑制作用。且EC小鼠体内具有保护作用的代谢产物2-MeOE2、2-MeOE1和4-MeOE1的水平明显下降，同时其具有毒性作用的代谢产物4-OHE2的含量明显增加；在给予Res治疗后，对应的代谢产物的水平也发生了相应的逆转，再次表明Res抑制了EC的发生发展。此外，在EC小鼠体内，2-MeOE2和4-OHE2的水平在子宫组织和外周血液中具有相似的变化趋势。提示外周血液中的2-MeOE2和4-OHE2有可能作为EC临床诊断的无创性生物标志物。