肉种鸡禽白血病与马立克氏病混合感染的初步诊断

史荣华 周扬 李一民 张建军 任丹 高巍

摘要    2018年11月，江苏省某肉种鸡场26周龄鸡群出现采食下降、精神沉郁、消瘦、产蛋下降、死亡等癥状，临床剖检主要病变为肝脏、脾脏肿大，表面可见灰白色结节，腺胃、肾脏肿大，胸骨上可见圆形白色肿瘤病灶。为了明确肉种鸡发病的原因及确定病原，无菌采取肝脏、肾脏等病变组织，开展了PCR鉴定和组织病理学观察等实验室诊断。结果表明，病料PCR检测禽白血病毒和马立克氏病毒为阳性，组织病理学观察发现肝脏、脾脏、腺胃、心肌内弥漫大量MD和ALV-J特有肿瘤细胞。上述结果初步表明，该病例为J亚群禽白血病病毒与马立克氏病病毒混合感染。

关键词    肉种鸡;禽白血病;马立克氏病;混合感染;诊断

中图分类号    S858.31        文献标识码    A        文章编号   1007-5739（2019）09-0199-03

禽白血病（AL）是由禽白血病病毒（ALV）感染引起的免疫抑制性疾病以及各种可传播的良性和恶性肿瘤[1]。ALV属于反转录病毒科C型反转录病毒属，分为A～K 11个不同亚群，其中A、B、C、D、E、J、K 7个亚群可自然感染鸡[2]，J亚群禽白血病病毒的致病力和感染性较强[3]，可引起肉鸡、蛋鸡、种鸡髓细胞样瘤细胞增生的一种肿瘤性疾病，在世界范围内广泛存在，目前临床上多见骨髓细胞瘤或血管瘤与骨髓细胞瘤混合发生的病例[4]。鸡马立克氏病（MD）是由马立克氏病病毒（MDV）引起的淋巴组织增生和淋巴肿瘤的一种疾病[5]。MDV属于疱疹病毒科一种α疱疹病毒，这种病毒具有高度的传染性，常以外周神经和其他各种组织器官的单核细胞浸润形成肿瘤为特征。根据病毒株抗原性差异分为3个血清型，并且2～18周龄的鸡均可感染发病，是危害养鸡业的重要传染病。禽白血病（AL）和马立克氏病（MD）是家禽常见的2种病毒性肿瘤病，可水平传播、垂直传播，不仅使感染鸡群的生产性能下降，而且容易引起免疫抑制，增加对其他疾病的易感性，给家禽养殖业造成巨大的经济损失[6]。2018 年11月江苏某肉种鸡场发生疑似肿瘤病的鸡群，经临床剖检及实验室鉴定为J亚群禽白血病病毒与马立克氏病病毒混合感染。

1    材料与方法

1.1    病料信息

病料来源于江苏省某肉种鸡场，26周龄黄羽肉种鸡，剖检疑似肿瘤病症状，无菌采集具有典型病变的肝、脾、肾等病料组织用于PCR鉴定以及组织病理学观察。

1.2    试验材料

DNA提取纯化试剂盒、2×Easy TaqSuperMix、普通琼脂糖凝胶、DL2000 DNA Marker，根据参照文献[7-8]设计了MDV、REV、ALV的鉴定引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，见表1。

1.3    PCR检测

采集病鸡肿瘤病变组织，按1∶5加入含适当浓度抗生素的灭菌PBS缓冲液，充分研磨，反复冻融3次后，离心取上清[2]，用DNA提取试剂盒抽提组织液中的DNA，置-20 ℃备用。以提取的病毒DNA作为模板进行PCR扩增。反应体系为：DNA模板2 μL，2×Easy TaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL。反应程序为：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30 个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经l%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳处理后置于凝胶成像系统中拍照鉴定。

1.4    病理组织学检测

用福尔马林固定病变组织（如肝脏、脾脏等），按文献[9]制作石蜡切片，苏木精-伊红染色，进行组织病理学诊断。

2    结果与分析

2.1    病鸡剖检症状

现场剖检发现，病死鸡主要表现为肝脏肿大，表面弥漫性灰白色肿瘤结节，见图1（a）（b）;脾脏肿大，有弥漫性灰白色肿瘤结节，见图1（c）（d）;胸骨内外侧有圆形白色肿瘤病灶，见图1（e）（f）;肠道表面白色肿瘤结节，见图1（g）;肾脏肿大，表面弥漫性白色肿瘤结节，见图1（h）。

2.2    PCR鉴定

PCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳分析，结REV-LTR引物未扩增出目的条带，MDV-meq扩增出目的条带，大小约为1 058 bp，ALV-P27扩增出目的条带，大小约348 bp（图2）。该病料PCR检测REV为阴性，MDV和ALV为阳性。

2.3    组织病理学检测

组织病理学显示：肝内多个肿瘤病灶，肝内肿瘤细胞为MD特有的肿瘤细胞，见图3（a）（b）;心肌内大量肿瘤细胞浸润，心肌内肿瘤细胞为MD特有肿瘤细胞，见图3（c）（d）;腺胃内大量肿瘤细胞浸润 腺胃内肿瘤细胞为MD特有肿瘤细胞，见图3（e）（f）;脾脏1内大量肿瘤细胞浸润，脾脏1内肿瘤细胞为ALV-J特有肿瘤细胞，见图3（g）（h）;脾脏2内大量肿瘤细胞浸润，脾脏2内肿瘤细胞为MD特有肿瘤细胞，见图3（j）（k）。

3    讨论

禽白血病和马立克氏病是2种病原（分别属于RNA病毒和DNA病毒）完全不同的疾病，并且都以类似的肉眼可见肿瘤病变为特征[10]。随着规模化养殖的扩大，家禽疫病已经变得日益复杂，混合感染已经成为肿瘤病毒、免疫抑制性病毒感染的主要方式，给养殖业造成巨大损失[11]。造成ALV和MDV混合感染的主要原因可能有以下几种：①ALV既可以垂直传播，又可以水平传播，祖代鸡场白血病净化不彻底，通过种鸡垂直传染给下一代，从而引起雏鸡产生免疫抑制，免疫应答下降，即使雏鸡接种MDV疫苗，仍会感染MDV野毒而发病;②除自然传播方式外，接种了被外源性ALV污染的弱毒活疫苗，也会引起ALV的感染;③雏鸡在免疫MDV疫苗时，免疫过程出现了问题，则会导致免疫效果降低或者免疫失败，使鸡群感染MDV野毒引起机体免疫抑制，最终通过水平传播感染ALV[5];④养殖环境生物安全方面的缺失、饲养环境恶劣、粗放的饲养管理等也会促进病原的扩散与传播[11]。

本试验从江苏省某肉种鸡场采集病料，根据临床解剖病变，PCR扩增及病理组织学分析，最终初步診断该病例为J亚群禽白血病病毒与马立克氏病病毒混合感染。J亚群禽白血病肿瘤的原发部位在骨髓，骨膜下可见白色石灰样增生的肿瘤组织，隆起于骨表面[12]。对于此种混合感染的情况，目前主要实行净化种群为主的综合性防制措施[10]。注射疫苗是预防MD的有效方法，从CVI988/Rispens、814株单苗到cVI988/

Ripense+HVI二联疫苗，每类疫苗能在一段时期内有效控制其发生[11];对于AL，目前还没有有效的疫苗，更没有有效的药物可以治疗。因此，比较好的办法就是加强净化淘汰，自行清除ALV—J阳性的鸡群或者引进国外鸡群时加强ALV—J筛查，最后逐步建立无ALV—J感染的鸡群，改善饲养环境[13]。同时，还应加强种鸡的饲养管理和严格的生物安全措施，以减少水平传播，并选择无外源病毒污染的疫苗进行合理免疫，避免因疫苗污染而导致鸡群感染禽白血病[14]。本试验诊断为该鸡场下一步的预防和净化工作起到一定的参考作用。

4    参考文献

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[13] 张志，赵宏坤，崔治中.J亚群禽白血病的诊断和防制[J].中国兽医杂志，2004，40（3）：36-37.

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作者简介   史荣华（1987-），男，江苏泰州人，硕士，从事病毒免疫学研究工作。

收稿日期   2019-01-08