大豆适应性的分子遗传基础

林晓雅，刘宝辉，孔凡江

广州大学 生命科学学院 分子遗传与进化创新研究中心，广州 510006

大豆(Glycine max)是一种敏感的高温短日照作物，是人类植物蛋白的主要来源。它起源于中国北纬30e～45e区域。成熟期是影响大豆产量的重要因素之一，早熟通常伴随着低产，而大豆对光周期的反应通常影响着成熟期的长短。目前，大豆可以种植在广大的地域，分布在北纬50e～南纬35e。然而，单个品种的生长通常限于狭窄的纬度范围，主要是由于大豆对光周期的高度敏感性。高纬度地区的主栽品种种植到低纬度地区会提早开花，植株矮小，结粒很少；低纬度地区的主栽品种种植到高纬度地区，则会开花时间过长，不能在冬天温度下降前结荚。因此，大豆光周期调控和开花的分子机制的解析可以为解决早熟与高产之间的矛盾提供理论依据，也可以为高产大豆的分子设计育种提供关键的核心模块，从而培育高产、优质的大豆栽培品种。

大豆总体而言具有广泛的生态适应性，但是单个大豆品种却只能适应狭窄的纬度范围。这似乎很矛盾，但它们之间可以通过控制大豆开花和成熟期的数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)的遗传变异和多样化来得到完美平衡。这些控制光周期开花和成熟的QTL在不同地方受到不同的选择压力并产生不同的自然变异，使得大豆具有适应不同区域的能力。利用经典遗传学方法，目前已经发现10个主要的控制开花期和成熟期的QTL：E1～E4、E6～E10和J[1-11]。显性E1、E2、E3、E4、E7、E8、E10基因通常导致晚花，而显性E6、E9和J基因导致早花(表1)。最近几年，随着大豆基因组测序的完成[12]，反向遗传学方法也揭示了许多对大豆开花至关重要的基因。

1 开花基因座的分子鉴定和基因克隆

1.1•E1基因

E1是影响大豆开花期和成熟期最重要的基因。E1基因位于大豆基因组6号染色体的着丝粒附近区域，编码一个20.3 kDa的蛋白，是一个负调节开花的豆科特异的转录因子。E1主要表达于叶片，在其他组织中的表达很低，其编码的蛋白定位于细胞核。天然突变的e1-as等位基因由于其核定位信号点突变而失去部分功能，导致一部分突变的蛋白质不能进入细胞核而无法行使功能，所以e1-as突变体的表型介于正常型和缺失突变体之间，是一个弱的等位变异(weak allele)[13]。E1基因参与调节大豆的光周期敏感性[14-15]。尽管E1基因在调节大豆光周期开花中起重要作用，但其同源基因在豆科植物中的功能似乎并不保守。大豆中异位过表达菜豆(common bean)E1同源基因PvE1L能抑制大豆开花，而MtE1L(来自于蒺藜苜蓿，Medicago truncatula)在大豆中异位过表达不影响其开花时间[16]。E1基因的转录水平在长日照下有两个峰；在短日照下，E1表达被严重抑制。E1在大豆中有两个同源基因E1La和E1Lb，它们也是大豆开花的抑制子，在长日照下的表达水平与E1相似[17]。利用近等基因系(near isogenic lines，NILs)，研究人员发现E1Lb在富含红光或富含远红光长日照条件下抑制开花的功能是独立于E1的[18]。特别地，e1lb可以抵消E4在富含远红光的长日照下抑制开花的功能[18]。

表1 大豆生育期基因的功能

1.2•E2 基因

E2，在生物钟调控和开花中具有多种功能，它是拟南芥GI的同源基因，通过在大豆中图位克隆确定[19-20]。E2在调控大豆农艺性状如开花、成熟、产量和种子质量方面都很重要[21-22]。研究表明，大豆中的E2和拟南芥中GI的功能可能已经分化：用E2全长基因转入拟南芥gi突变体，完全不能互补其表型；在野生型拟南芥Col-0中转入E2全长基因，却可以导致拟南芥晚花[23-24]。E2通过抑制GmFT2a转录来调节开花，但是其中具体的分子调控机制尚不清楚[20]。通过研究中国不同地区栽培大豆和野生大豆的E2单倍型，研究人员发现E2单倍型多样化可能有助于大豆开花时间适应，这种适应性促进驯化大豆的扩散[24]。E2基因座不参与调节光周期敏感性[15,25]。

1.3 E3 和E4 基因

E3和E4基因被证实是拟南芥光敏色素A(PHYA)基因的同源基因，分别为GmPHYA3和GmPHYA2[26-27]。E3和E4在自然条件和实验室光条件下的光周期开花中都起着至关重要的作用[14-15]。在拟南芥中，phyA仅在远红光富集条件下或者自然光下调节光周期开花[28-29]。这表明大豆的phyA可能已经演化出新的功能。大豆E3和E4的功能也已经亚功能化，大豆E3基因座控制荧光灯(高比例的红光/远红光)下长日照的光周期敏感性，而E3和E4基因座协同调节在白炽灯(低比例的红光/远红光)下的光周期敏感性[30]。因此，E3和E4在信号转导中可能具有某些功能冗余，同时也具有某些特异性。另一方面，大豆还具有另外两种phyA的同源蛋白：GmphyA1和GmphyA4。GmphyA1和E4可协调调节低比例的红光/远红光下的光形态建成[27]，而GmphyA4可能是假基因[31]。核苷酸多样性揭示GmphyA1在非同义位点具有比E4更低的核苷酸多样化，表明GmphyA1可能具有的重要功能[32]。GmphyA1很可能调节更低比例红光/远红光（<1.0）的长日照条件下的光周期敏感性，因为具有双隐性等位基因(e3e3e4e4)的大豆在这种条件下表型为延迟开花[8,30,33] 。

1.4 E6 和•J 基因

E6和J基因座的隐性等位基因是大豆适应低纬度和延长生育期所必需的[5,34]。利用近等基因系材料，研究人员发现：E6E6比e6e6早开花，在12 h的日照长度的时候达到最大化的差异[35]；E6基因开花的延迟效应只能在短于14 h的日照时长内检测到，在16 h光照的长日照下，E6E6和e6e6开花时间没有差异。E6基因尚未确定，但遗传研究表明E6和J基因座可能紧密关联[11]。J基因通过正向遗传学、QTL克隆和精细图位克隆的方法获得[10,36]。当由拟南芥EARLY FLOWERING 3(ELF3)启动子驱动的J转化到拟南芥elf3-8突变体时，可以互补突变体提早开花的表型，证明J是拟南芥ELF3同源基因，并且该基因的功能进一步通过大豆转基因互补实验和近等基因系材料进一步验证。J蛋白在短日照和14 h的长日照条件下都能发挥作用[10]。J在短日照下通过抑制E1转录来调节开花[10]。

1.5•E7 和•E8 基因

E7位点可以在白炽光或自然光的长日照条件下延长开花期和成熟期，但不能在高比例红光/远红光下延长开花时间[7]。E8E8导致晚熟，而e8e8则提早成熟[37]。研究表明E7位于6号染色体上，并与E1位点轻微连锁。E1和E7之间的遗传连锁估计为6.2厘摩(centimorgan)[38-39]。因此基于它们的基因组位置，两个E1L基因(位于4号染色体上)或GmphyA1基因(位于10号染色体上)都不是E7的候选基因。由Suinong 14和Enrei亲本(均具有E1e2e3E4基因背景)产生的重组自交系(recombinant inbred lines，RILs)，在6号染色体上具有控制开花时间、成熟期和繁殖期的主要QTLü 这个QTL很可能是E7[40]。E8位于染色体4中，这条染色体上含有两个E1L基因[37]。由Dongnong 50和William 82亲本(均具有e1-asE2E3E4基因背景)产生的RILs，在4号染色体上具有控制开花时间、成熟期和繁殖期的主要QTLü 这个QTL很可能是E8[40]。还有报道显示位于4号染色体上的QTL与E8相似，调节开花时间和成熟期[41-42]。但是，直到现在还没有真正确定E7和E8位点的基因。

1.6•E9、E10 和其他•FT 同源基因

FT蛋白属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族，是一个关键的开花整合因子。FT蛋白质通过韧皮部从叶片转移到侧顶端分生组织并诱导花分生组织的发育，它们是开花途径的主要输出信号。大豆具有12个FT样(FT-like)基因座位：GmFT1a、GmFT1b、GmFT2a、GmFT2b、GmFT2c、GmFT2d、GmFT3a、GmFT3b、GmFT4、GmFT5a、GmFT5b和GmFT6。其中GmFT2c基因中具有转座子的插入导致其成为一个假基因，而GmFT2d具有结构重排，导致该基因的功能丧失[43-44]。短日照条件下大豆三出复叶中GmFT2b、GmFT4、GmFT5b和GmFT6的表达几乎检测不到[43]。当GmFT2a、GmFT2b、GmFT3a、GmFT3b、GmFT5a和GmFT5b以35S启动子驱动异位在拟南芥中表达时，可以促进拟南芥开花，表明这些基因可能是开花的诱导因子[43,45-46]。当在大豆中使用RNAi技术将这些GmFT的表达下调时，大豆的开花时间被延迟了[46]。还有实验证明，通过在大豆中过表达GmFT2a或GmFT5a，可以诱导大豆提早开花[46-47]。在用CRISPR/Cas9系统定点诱变大豆GmFT2a基因后，开花也能被延迟[48]。E9被证明是GmFT2a[6,49]。E1、E3和E4可以抑制GmFT2a和GmFT5a的转录水平[43,50]。

GmFT1a和GmFT4是开花抑制因子，其在长日照下高表达，在短日照中低表达，并且过表达实验证明GmFT1a和GmFT4是延迟开花的因子。此外，E1可以诱导GmFT1a和GmFT4表达[51-52]。E10被证明是GmFT4[9]。GmFT1b与这两个基因表达模式相似，即长日照下的表达高于短日照，所以它可能也是开花的抑制因子[52]。当异位表达拟南芥中的GmFT6时，开花时间不受影响[45]。然而，当它由At TFL1本源启动子驱动，转入到tfl1-1突变体时，它可以完全互补tfl1-1提早开花表型，表明其蛋白质功能与At TFL1类似，是开花抑制因子[53-54]。

这些基因座上的各种天然等位基因突变为大豆的广泛适应性提供了条件。除了这些基因外，近年来大豆同源基因在拟南芥开花相关基因中的功能也得到了一定的研究[45,55-60]。这些为我们深入和全面地了解大豆光周期开花的机制打下了基础。

2 大豆在长日照条件下的适应性

为了适应高纬度地区的长日照条件，大豆需要减少或完全失去光周期敏感性，即在长日照条件下提早开花。E3基因座参与感受荧光灯(红光/远红光为比例4.9～5.9)长日照(fluorescent long day, FLD)条件的光周期敏感性[30]。但是在自然光的条件下，红光/远红光的比例要低得多：在日中，红光/远红光的比例为1.05～1.25；在清晨和黄昏的时候，红光/远红光的比例在0.65～1.15。所以大豆进化出了更加复杂的机制来应对低比例的红光/远红光下的光周期敏感性，我们称之为白炽灯长日照(incandescent long day, ILD)不敏感性。通常，验证ILD不敏感性的实验是在自然光和自然光的基础上用白炽灯延长到日照时间为20 h下分别种植同一基因型的植株，比较这两种条件下种植大豆的开花时间，如果开花的时间没有差别，就认为它是对ILD不敏感的[30]。

据报道，3个成熟期位点E1、E3和E4在减少对ILD的敏感性方面起主要作用[15,30,61-62]。第一种对ILD不敏感的基因类型是同时缺失E3和E4基因型。这种类型也是最主要的ILD不敏感的机制，占了高纬度地区光周期不敏感植株的70%的基因型。虽然e3e3e4e4对用白炽灯延长到日照时间20 h的光周期是不敏感的，但是这种基因型在20 h的白炽灯光周期下相比12 h的白炽灯光周期下，开花时间仍然有明显的延长，说明还有其他的基因在起作用[30]。第二种对ILD敏感性降低的基因型是功能缺失的e1和e3或e4等位基因。单独将E1位点的功能缺失不能导致ILD不敏感，可能是因为存在E1L基因。我们可以从夜间打断反应(night break responses)中了解E1L基因对光敏感性的影响。夜间打断实验是研究光周期的一种方法，是将完整的夜晚用一段时间的光照打断，以研究植物对光周期的敏感性。缺乏功能性E3和E4基因的大豆对夜间打断处理不敏感。然而，在植物缺失E1的情况下，打断夜间响应仍然有部分保留。在e1背景下，同时用RNA干扰敲除E1La和E1Lb的植株中，夜间打断反应就消失了[17]。这说明在没有E1时，E1L还能起一定的调控光周期的作用。此外，除了调节E1的表达外，E3和E4还调节E1La和E1Lb的表达[17]。最后一种对ILD光周期不敏感的基因类型是e1-as e3E4，在这种遗传背景下，存在对ILD敏感和对ILD不敏感的大豆品种，因此至少一个尚不明确的基因位点参与调控光周期不敏感，以调节对富含远红光的长日照的敏感性[15]。最近的研究表明，E1Lb是最有可能参与这种遗传背景来调控ILD不敏感的[18]。

可以从已有的数据推测，大豆对光周期的敏感性主要是通过phyA和E1以及它们的同源蛋白介导的。因为缺乏遗传材料，所以GmphyA1和E1La的功能没有得到充分的研究。这并不能代表它们不在调控光周期的敏感性中起作用，有可能它们在非常低比例的红光/远红光下起作用。在用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了GmPHYA以及E1/E1L的单突变体以及多突变体后，可以更好地研究它们在不同比例红光/远红光下光周期敏感性。

3 大豆在短日照条件下的适应性

巴西是世界第二大豆生产国。1960年以前，巴西的品种都从美国进口，但是仅限于在纬度大于22e的地区种植。在1970年引入长童期(long juvenile，LJ)性状之后，大豆种植的局限性被打破，这些大豆在热带地区种植也能得到很高的产量[63-64]。LJ性状是指大豆品种在短日照条件下，延长营养生长期，延长大豆开花和生长期，增加大豆光合周期和生物量，最终提高产量的能力。到目前为止，关于LJ性状的研究很少，只有J基因座基因已被克隆。

在短日照条件下，J蛋白可与E1启动子区的LUX结合元件结合，抑制E1基因的表达，从而释放E1对FT基因表达的抑制作用。J基因的表达受光敏色素蛋白E3和E4的调控。因此，J通过E1并在E3和E4的控制下调节大豆生长期和产量。需要进一步研究在短日照和长日照条件下的J蛋白水平，以及J蛋白水平是否也受E3和E4调节。在低纬度条件下(短日照条件下)，J基因突变可以延缓大豆成熟，大大提高大豆产量。与野生型J相比，突变体j可使大豆产量增加30%～50%。适应低纬度的大豆栽培品种中存在至少8个J功能缺失等位基因变异。J基因中多个突变的出现是大豆适应低纬度和增加产量的重要进化机制，而低纬度环境胁迫是J基因变异的主要驱动力[10]。在育种中，为了让高纬度地区的主栽优质品种可以适应低纬度地区，可以将J突变的位点通过杂交的方式引入其中，使它们能够在低纬度地区获得较高的产量。

4 大豆特异开花调控途径

在过去的几十年中，通过研究模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)，我们对光周期开花调控的基本框架和机制进行了系统而深入的了解。拟南芥是一种长日照植物，它的光周期调控以CO-FT为主。FKF-CDFGI蛋白复合物调节CO基因的特定生物钟模式转录表达，CRY1/2-COP1复合物、phyA和phyB调节转录后水平的CO蛋白积累，从而调节FT表达丰度，控制开花[65-68]。ELF3提供了COP1与GI形成复合物的平台，并让COP1降解GI。GI是一种众所周知的CO激活子，也可以直接结合FT的启动子区域来调控开花[69-70]。CO直接与FT的启动子区域结合并使其表达降低[71]。水稻是一种短日照植物，具有类似于拟南芥的Hd1(CO)-Hd3a(FT)途径和水稻特异性Ghd7-Ehd1-RFT1(FT)调节途径[65,72-74]。Hd3a是短日照主导的开花因子，而RFT1在长日照条件下占主导地位[75-76]。Hd1在短日照下诱导Hd3a，在长日照下却抑制Hd3a，并且长日照抑制作用是PHYB依赖的[77-79]，而我们不知道调节机制。虽然Hd1和Hd3a的分子特性分别类似CO和FT，但目前没有关于Hd1与Hd3a启动子结合以直接调节其表达的报道。Hd17/OsELF3参与生物钟调节并通过抑制Ghd7和Hd1表达促进开花[80-82]。

尽管在大豆中存在许多调节光周期开花的信号传导途径[33,83-84]，但大豆也存在一条特异性调节途径。该途径以phyA开始并最终体现在GmFT表达水平变化上，但重要的核心转录因子已经变为E1。在长日照条件下，E3和E4协同延迟开花，GmFT5a和GmFT2a受主要成熟基因E1、E3和E4控制。E3和E4诱导E1表达。对于E1基因的调节，E3和E4出现了功能分化：E3强烈诱导E1基因的表达，E4对E1的诱导相对较弱[56]。E1抑制GmFT5a和GmFT2a的表达[13,43,50]，从而延迟开花。此外，E1诱导GmFT1a和GmFT4这两个开花抑制因子[51-52]。E1Lb的转录也受E3和E4的控制[17]，并且它在红光/远红光高比例条件下在由E4介导的信号通路中起主要作用[18]。尽管E1和E1lb独立地起作用，因为缺乏它们任何一个都可以导致大豆的开花时间提早，但是E1和E1La/b的总体水平对于下游GmFT2a和GmFT5a表达可能是重要的[18]。大豆中光周期开花分子调控途径的模型是phyA(E3E4)-E1/E1LFT。

在短日照下，E3和E4的功能大大降低，同时E3和E4的突变只会对开花时间产生轻微影响[10]。E1的表达在短日照条件下也受到抑制，除非阻遏物J突变，导致E1在短日照下的黄昏时分表达上调，使得开花延迟[10]。J在LUX结合元件上与E1启动子结合，这也暗示着生物钟晚间复合体(evening complex)ELF4-ELF3-LUX在此处起作用[85]，所以GmELF4和GmLUX对大豆光周期开花很可能也有作用。J对E1L的调控作用尚不清楚。尽管肯定还有其他因子在短日照下控制J的表达，但E3和E4可以部分地调控J的表达。我们所提出的短日照下大豆中光周期开花分子调节途径的模型是phyA(E3E4)-J-E1-FT(图1)，同时可以得出结论：E1是作为开花的核心转录因子，整合了光信号和生物钟信号，类似于拟南芥开花途径中的CO。

在长短日照下，开花诱导因子GmFT2a和GmFT5a都会从叶片移动到顶端分生组织中，它们通过与GmFDL19互作，并直接结合到GmAP1a启动子的顺式作用元件上调控GmAP1a的表达，从而影响开花[86](图1)。

图1 大豆光周期调控开花的分子机制示意图。E3和E4抑制J的表达，促进E1的表达，具体机制未知。J通过LUX结合元件结合到E1的启动子上，直接抑制E1的表达。E1是一个转录因子，可能通过结合到FT2a和FT5a的启动子上抑制它们的表达。FT2a和FT5a通过维管束从叶片转移到花分生组织，与FDL19互作后，结合到AP1的启动子区域，促进AP1的表达上调，起始开花。在长日照下，J的功能未知

在另一种长日照植物豌豆(Pisum sativum)中，其光周期开花机制也被深入地研究。与在大豆中一样，phyA在感知日照时长方面至关重要，它也只在长日照条件下起作用[87-88]。生物钟晚间复合体ELF-ELF4-LUX在光周期敏感性中发挥重要作用，特别是在短日照下[92]。尽管豌豆中尚未发现调控开花的核心转录因子，但也发现了对应的FT[93]。虽然发现的方式不同，但从大豆和豌豆中鉴定出的重要调节成分是相似的[94]，表明豆科植物中可能存在保守的光周期开花调控机制。

5 结束语

多年来，大豆光周期开花的研究进展缓慢，但近年来已取得一系列突破。负责E1、E2、E3、E4、E9、E10和J基因座的基因已被确定，这极大地提高了我们对大豆光周期开花的理解。拟南芥和光周期开花的模型对于研究大豆光周期开花具有指导意义，拟南芥中的基础研究推动了我们对大豆光周期开花机制的认识。在大豆中，其机制与长日植物拟南芥的机制不太相同。E1是拟南芥中不存在的豆科植物特异性转录因子，而在大豆光周期开花中起重要作用。除此之外，E2、E3和E4的分子特性也可能已经发生变化。研究大豆独特的光周期开花的机制有助于从分子水平解析大豆的适应性机制，从而为优质、高产大豆的推广提供理论依据。

但是，要清楚地了解光周期如何调节大豆开花，还有许多问题需要解决。例如：E3和E4如何在长日照下调节E1表达？为什么E3和E4的功能在短日照下会受到很大影响？J是否在长日照下也能发挥作用？拟南芥中开花核心转录因子CO的调节非常精确。除了调节CO的转录水平外，蛋白质水平的调节也很重要[95-99]。作为控制大豆开花的核心转录因子，E1蛋白水平的调节也应该是重要的，但E1的蛋白质水平仍然是一个谜。需要进一步的研究来阐明大豆光周期开花的分子机制。在大豆中生物钟相关基因的功能还亟待被鉴定，虽然J与大豆开花核心转录因子E1的功能被初步阐明，但E2的调控关系还基本不明确；目前已经报道的生育期相关的位点之间的互作关系需要被进一步鉴定。更多拟南芥开花相关基因在大豆中同源基因的功能也需要被研究，以完善我们对大豆光周期开花的理解。