HPLC/UV测定鹅不食草中五种倍半萜内酯成分含量△

任海琴，吕秋月，彭玉德，林雨珊，王立晶，陈四保，*

1.香港理工大学 深圳研究院 中药药学及分子药理学国家重点实验室(培育基地)，广东 深圳 518057；2.中国医学科学院，北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；3.广西药用植物园，广西 南宁 530023

鹅不食草Centipedaminima(L.)A.Br.et Aschers.系菊科(Asteraceae)石胡荽属植物，又名石胡荽，其全草为常用中药，具有发散风寒，通鼻窍，止咳之功效；临床上用于治疗急慢性、过敏性鼻炎，病毒性感染等[1]。鹅不食草中含有黄酮、苯丙素、倍半萜等化学成分[2-4]；具有抗氧化、抗炎[5]和抗肿瘤活性[6-7]。

对于鹅不食草的质量控制，《中华人民共和国药典》(2015版)缺少含量测定。已报道的含量测定方法主要是分析有机酸和黄酮类成分[8-10]。但越来越多的研究表明，鹅不食草的抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性与其中的倍半萜内酯化合物有关[4，11-14]，因此，测定倍半萜内酯化合物的含量，可以更加科学地反应鹅不食草药材的质量。然而，迄今为止，对鹅不食草中的倍半萜内酯含量测定，仅见对其中两个成分的测定[10，15]。

为了更加客观地反应鹅不食草的药材质量，本研究建立了高效液相测定5个主要倍半萜内酯化合物的含量测定方法，为鹅不食草的质量控制提供研究基础。

注：1.山金车内酯D；2.山金车内酯C；3.minimolide F；4.小堆心菊素C；5.短叶老鹳草素。图1 对照品化学结构式

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪、SPD-20A紫外检测器(日本岛津公司)；XS205型十万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；AY220型万分之一电子天平(日本岛津公司)；Elmasonic P 180H型超声波清洗器(德国Elma公司)；HETTICH ZENTRIFUGEN 1205型离心机(德国Hettich Zentrifugen公司)；Milli-Q超纯水机(德国密理博公司)。

1.2 试药

对照品：山金车内酯D、山金车内酯C、Minimolide F、小堆心菊素C和短叶老鹳草素均为本实验室从鹅不食草中分离得到，其化学结构(如图1所示)通过测定它们的谱学数据(IR，UV，MS，NMR)并对照文献而确定[16]，其纯度由HPLC面积归一化法测定均大于98%。甲醇和乙腈均为色谱纯(Fisher化学试剂公司)；超纯水由Milli-Q制备。10批样品采自于不同产地，经香港理工大学深圳研究院陈四保教授鉴定为鹅不食草Centipedaminima(L.)A.Br.et Aschers.的干燥全草(表1)。

表1 鹅不食草样品信息

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱为AlltimaTMC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相由水(A)-乙腈(B)组成，梯度洗脱(0～12 min，38%～44% B；12～25 min，44%～47% B；25～30 min，47%～50% B)；检测波长223 nm；流速1.0 mL·min-1；进样体积20 μL；柱温35 ℃。

2.2 对照品溶液制备

取对照品山金车内酯D 3.0 mg，山金车内酯C 3.0 mg，minimolide F 9.0 mg，小堆心菊素C 9.0 mg和短叶老鹳草素8.0 mg，精密称定，用甲醇10 mL溶解，并定容至刻度，即得浓度分别为300、300、900、900、800 μg·mL-1的各对照品储备溶液；分别精密量取各对照品储备溶液1.0、1.0、0.1、0.1、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配置成含山金车内酯D 30 μg·mL-1，山金车内酯C 30 μg·mL-1，minimolide F 9 μg·mL-1，小堆心菊素C 9 μg·mL-1和短叶老鹳草素80 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 样品溶液制备

取鹅不食草样品(批号EBSC-1)粉末(过2号筛)0.5 g，精密称重，置于50 mL离心管中，加甲醇10 mL，超声处理30 min(功率330 W，频率37 KHz)，离心5 min(4000 r·min-1)，收集上清液；残渣加5 mL甲醇重复提取1次，离心，收集上清液；残渣用5 mL甲醇清洗，离心，合并3次上清液于25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适应性考察 精密量取2.2项下制备的混合对照品溶液0.5 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取20 μL，进行HPLC分析，重复6次，记录各对照品色谱峰的保留时间和峰面积，计算相对标准偏差(RSD)。结果显示，5个成分的保留时间和峰面积RSD均小于2%。同样，取3批不同样品溶液(EBSC-1，EBSC-2，EBSC-3)，进行HPLC分析，记录各待测化合物色谱峰与最近色谱峰之间的分离度(R)、理论塔板数(N)和拖尾因子(T)。结果显示(图2)，各色谱峰与邻近的峰分离度(R)均大于1.5，各峰的N值均大于10 000，T值介于0.95～1.10之间，表明该方法具有良好的系统适应性。

2.4.2 线性关系、检测限和定量限考察 将2.2项下制备的混合对照品溶液分别稀释至6个不同的浓度，每个浓度按上述的色谱条件进样分析3次。以对照品峰面积为纵坐标(Y)，浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)，进行回归分析，求得各回归方程和线性范围。结果表明5种成分在测定范围内线性关系良好。采用信噪比法测定5种指标成分的检测限LOD(信噪比S/N=3∶1)及定量限LOQ(信噪比S/N=10∶1)，结果见表2。

注：1.山金车内酯D；2.山金车内酯C；3.minimolide F；4.小堆心菊素C；5.短叶老鹳草素。图2 对照品(a)和样品溶液(b)色谱图

2.4.3 精密度试验 精密吸取2.4.1项下制备的混合对照品溶液20 μL，进行HPLC分析，在同1天之内重复测定6次，记录峰面积，计算峰面积的RSD，考察日内精密度实验；连续测定3天，每天测定2次，考察日间精密度。结果如表3所示，5种成分的峰面积的RSD均小于1%(n=6)，表明本方法精密度良好。

表3 精密度、稳定性和重现性测定结果

表2 5种倍半萜内酯化合物的线性考察、检测限和定量限 μg·mL-1

2.4.4 重现性试验 取样品粉末(EBSC-1)，精密称定6份，分别按照2.3项下方法制备样品溶液，按2.1项下色谱方法测定，计算含量及其RSD。结果如表3所示，5种成分含量的RSD均小于3%(n=6)，表明本方法重现性良好。

2.4.5 稳定性试验 取室温下放置的同一份样品溶液(EBSC-1)，分别于制备后0、2、4、8、16、24、48 h，按2.1项下色谱方法测定，记录峰面积，计算RSD值。结果如表3所示，5种成分峰面积的RSD均小于3%(n=7)，表明样品溶液在48 h内稳定。

2.4.6 回收率试验 取已知含量的样品(EBSC-1)粉末6份，每份约0.25 g，精密称定，每份样品中精密加入一定量的对照品溶液，按照2.3项下方法制备样品溶液，按2.1项下方法测定各化合物的含量，计算回收率及RSD，结果如表4所示，5种成分的平均回收率在94.09%～106.32%，对应的RSD分别均小于2%，表明方法的准确度良好。

表4 鹅不食草回收率测定结果

2.5 样品含量测定

取各样品粉末，精密称定3份，分别按2.3项方法制备样品溶液，精密吸取各样品溶液20 μL，按2.1项下色谱条件进行测定，用外标法计算出含量，结果见表5，色谱图见图2。

表5 鹅不食草样品中5种倍半萜内酯化合物的含量(n=3) μg·g-1

3 讨论

3.1 样品溶液制备

鉴于倍半萜内酯化合物脂溶性较大，重点考察了无水有机溶剂甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮对鹅不食草的提取效果，结果发现甲醇提取后所测得的各指标成分平均含量较高；考察了回流和超声两种提取方式，结果显示两种提取方法提取效率差异不大，考虑到超声法简便易行的优势，故选择超声法作为样品提取方法；考察了超声次数(每次30 min)的提取效果，结果发现提取2次即可提取完全；因此最终样品溶液制备方法为甲醇超声提取30 min，提取2次。

3.2 色谱条件

流动相考察了水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇和0.1%甲酸水-乙腈，结果发现水-乙腈为流动相进行梯度洗脱，各色谱峰的分离度最好，5个待测成分的色谱峰纯度也都符合含量测定要求；通过PAD检测器优选了检测波长，发现223 nm下各被测物色谱峰强度最高，因此选用223 nm作为检测波长；将柱温设置在35 ℃，能使色谱基线平稳。

3.3 样品含量测定

对10批次鹅不食草样品进行了含量测定，各化合物含量在不同的样品中差异较大，5个化合物的含量范围分别为山金车内酯D 423.3～1 437.2 μg·g-1，山金车内酯C 144.1～498.0 μg·g-1，minimolide F 29.8～159.2 μg·g-1，小堆心菊素C 66.8～188.8 μg·g-1和短叶老鹳草素1 290.1～3 476.4 μg·g-1；从它们的平均含量可以看出，短叶老鹳草素>山金车内酯D>山金车内酯C>小堆心菊素C>minimolide F，短叶老鹳草素含量最高，平均含量达到2 224.9 μg·g-1，其次为山金车内酯D，平均含量为765.7 μg·g-1。

3.4 小结

鹅不食草是常用中药，具有抗炎、抗肿瘤活性，临床上常用于治疗鼻炎和鼻咽癌[17-18]。现代研究表明其有效成分为倍半萜内酯成分，因此，有必要建立该类成分的含量测定方法，以求达到客观地、准确地评价鹅不食草药材的内在质量。本研究建立了HPLC/UV测定鹅不食草中山金车内酯D、山金车内酯C、minimolide F、小堆心菊素C和短叶老鹳草素等5种倍半萜内酯成分含量的方法。样品采用甲醇超声提取，选用AlltimaTMC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为水-乙腈，梯度洗脱，检测波长223 nm，流速1 mL·min-1，柱温35 ℃。系统适应性和方法学考察表明，该方法精密、准确、灵敏度高、重现性好。

对不同产地的鹅不食草样品进行了测定，结果表明5种成分在不同批次的鹅不食草药材中的含量差异显著，说明不同产地的鹅不食草中的倍半萜内酯成分会随着地理环境、气候、光照条件的差异发生变化。短叶老鹳草素和山金车内酯D的含量较高，文献报道也具有显著的生物活性[12-14]，可作为鹅不食草质量控制中指标性成分。综合以上结果，该方法操作简单、准确、灵敏度高、重复性好，对鹅不食草的质量评价与控制具有一定的参考意义。