核磁共振氟谱法测定氟他胺含量的实验设计

邓冬艳， 宋红杰， 齐 悦

(四川大学 化学学院，成都 610064)

0 引 言

氟他胺(FLA，2-甲基-N-[4-硝基-3-三氟甲基苯基]丙酰胺)为非甾体类雄激素拮抗剂。该药物及其初级羟基代谢产物可通过第二性器官的靶细胞中的细胞色素P-450系统减少C-19甾体的代谢。能在细胞水平与雄激素竞争雄性激素受体，抑制雄激素依赖性的肿瘤细胞生长，进而达到抑制前列腺癌生长的目的，能较好地缓解前列腺癌骨转移所带来的疼痛[1-3]。目前，报道的氟他胺的分析方法包括分光光度法[4]、气相色谱法[5]、高效液相色谱法[6-7]、电化学法[8-10]以及化学发光法[11]等。这些方法通常存在冗杂的样品制备、繁琐分析方法的构建等缺点。而基于核磁共振波谱法分析研究氟他胺尚未见报导。目前核磁共振技术已经被纳入中国药典，广泛用于药品含量的定量分析。由于氟他胺含有氟原子，设想利用灵敏度高的核磁共振氟谱法(19F NMR)对氟他胺进行定性与定量分析。

核磁共振检测不破坏样品结构，能够保持体系的完整。而核磁共振氟谱测试无需使用氘代试剂，可以在任何溶液体系下进行检测。由于含氟化学药品的不断增加，定性用核磁共振氟谱日益受到关注，但是19F NMR定量技术用于含氟化学药品含量测定的研究还很少[12-15]。从天然丰度等方面考虑，核磁共振氟谱的检测灵敏度和氢谱相当(≈0.83倍)[13]，其测试时间及样品浓度均远小于13C、15N与31P谱。但是相比于核磁共振氢谱，氟谱具有更宽的化学位移范围，信号峰重叠少，易于分辨并进行峰强度的比较。同时，常见含氟化学药品中大多数只含有1种或2种不同化学环境的氟原子，使得19F NMR谱复杂程度远小于1H NMR谱。由此，利用19F NMR定量技术进行含氟化学药品的含量测定具有显著优势，可为准确测定该类药品的含量提供一种快速、准确且干扰较小的研究方法。

本文设计了利用核磁共振氟谱技术测定氟他胺含量的实验。实验通过设定适宜的测试参数，选取三氟甲苯为内标物，利用化学位移标定归属，进一步由特征峰的相对积分值进行定量分析。该实验方法简单，重复性好，易于实现。

1 实 验

1.1 主要试剂、材料与仪器

试剂与材料：本实验中所用全部试剂均为分析纯及以上。氘代氯仿购自青岛腾龙微波科技有限公司，氟他胺及三氟甲苯(1.188 6 g/mL)购于阿拉丁试剂公司。

试验仪器：核磁共振波谱仪(AVANCE III HD, 400 MHz, Bruker, Germany)。仪器相关信息，1H 400.13 MHz；19F 376.47 MHz。

1.2 样品制备

1.2.1 内标物溶液的配制

吸取0.10 mL三氟甲苯至9.90 mL 氘代氯仿配成11.886 mg/mL的储备液待用。

1.2.2 氟他胺标准溶液的配制

称取氟他胺标准品至氘代氯仿配制浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mg/mL的标准溶液，分别加入0.05 mL内标物溶液，然后移至核磁管内。

1.3 检测方法

1.3.11H NMR测定

氢谱分析条件：测定温度25 °C；检测频率400.13 MHz；谱宽7 211.54 Hz；脉冲宽度12.0 μs；采集时间4.54 s；延迟时间1.0 s；增益值80.6；采集100次。

对配制好的氟他胺标准溶液进行核磁氢谱测定，设置参数后做1H NMR谱图。吸收峰准确定标，调整峰相位，使峰形左右对称，调整基线。

1.3.219F NMR测定

氟谱分析条件：测定温度25 °C；检测频率376.47 MHz；谱宽5 647.59 Hz；脉冲宽度13.5 μs；采集时间11.6 s；延迟时间1.0 s；增益值203；采集64次。

对配制好的氟他胺标准溶液进行核磁氟谱测定。设置参数后做19F NMR谱图。吸收峰准确定标，调整峰相位，使峰形左右对称，调整基线。

1.3.3 标准曲线的绘制及重复性实验的测定

将配制好的浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mg/mL的氟他胺系列标准溶液，分别加入50 μL三氟甲苯内标物溶液，进行19F NMR测定。对氟他胺和三氟甲苯内标物的特征峰进行积分，标识为S1和S2。然后以样品积分面积与内标物的积分面积比S1/S2为纵坐标，以样品的浓度与内标物的浓度比C1/C2为横坐标，绘制标准曲线。

取上述同一氟他胺标准品溶液放入核磁管进行氟谱扫描，按照1.3.2的操作方法连续测定5次，每次谱图反复积分3次，记录氟他胺定量峰与三氟甲苯内标峰积分面积比值，计算相对标准偏差(RSD)。

2 结果与讨论

2.1 氟他胺核磁共振氢谱分析

测定氟他胺标准品1H NMR，结果如图1所示。标定氘代氯仿的残余溶剂峰δ为7.26×10-6，可得氟他胺氢谱信号峰主要出现在(1.0～8.5)×10-6之间，各信号峰的归属分析结果表明其符合化合物结构。

图1 氟他胺标准品在氘代氯仿中的1H NMR谱图

2.2 内标物和定量峰的选择

根据内标物的选择要求[13]，拟选取的三氟甲苯具有较高的纯度，化学性质稳定；与被测物质氟他胺的化学性质相近，不与样品中的物质发生反应。

由图2可知，内标物的特征峰与被测物的特征峰完全分离，不存在干扰；对不同的物质峰进行归属，在化学位移δ=-61.10×10-6和δ=-63.72×10-6出现两个较大的尖锐峰，且无其他杂峰干扰。因此，三氟甲苯可选作内标物。同时，三氟甲苯分子只含有一种氟原子，根据图2内插图可得，δ=-63.72×10-6处信号为三氟甲苯的特征峰，则δ=-61.10×10-6处为氟他胺的特征峰，该峰峰形尖锐，易于积分用于定量分析，故选作定量峰。本工作选择氘代氯仿作为溶剂，能够很好地溶解氟他胺和三氟甲苯，且氘代氯仿不含氟，亦不会干扰内标物和分析物的谱峰。内标物及分析物的19F NMR谱见图2。

图2 氟他胺与三氟甲苯在氘代氯仿中的19F NMR谱(注: a为氟他胺，b为三氟甲苯；内插为三氟甲苯在氘代氯仿中的19F NMR谱)

2.3 线性关系考察

准确配制浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mg/mL的氟他胺系列标准溶液，分别加入50 μL内标物溶液，测试19F NMR谱图，结果如图3所示。

图3 核磁共振氟谱测定氟他胺的积分面积与浓度线性关系

结果表明，氟他胺浓度为0.2～10.0 mg/mL时，S1/S2与C1/C2呈现良好的线性关系，回归方程为y=0.574x-0.053，相关系数R2=0.996。表明以三氟甲苯为内标物，核磁共振氟谱法用于氟他胺的定量测定线性关系良好，该方法是可行的。

2.4 定量限与检出限

采用设定的氟谱测试条件，本实验以信噪比S/N>10作为定量限的标准，以S/N>3作为检出限的标准。由此，计算得到氟他胺的定量限为18 μg/mL，检出限为50 μg/mL。而线性关系曲线中氟他胺溶液的最低浓度为0.2 mg/mL，满足定量限的要求。

2.5 重复性实验

取上述同一氟他胺标准品溶液(2.0 mg/mL)放入核磁管进行氟谱扫描，按照1.3.2的操作方法连续测定5次，每次谱图反复积分3次，记录氟他胺定量峰与三氟甲苯内标峰积分面积比值。所得的RSD为1.94%。表明该方法的精密度良好，实验结果见表1。

表1 氟他胺精密度实验结果

3 结 语

本实验以三氟甲苯为内标物，利用化学位移标定归属，进一步由相对积分值进行定量分析。利用核磁共振技术，以化学位移δ=-61.10×10-6处的氟他胺的单峰作为定量峰，得到其峰面积比与其浓度比线性回归方程为y=0.574x-0.053，线性关系良好，实现了氟他胺的核磁共振的准确含量测定。该实验设计不仅拓展了19F核磁共振定量方法在含氟药物含量测定中的应用，而且有效加强了学生对核磁共振定量分析方法的理解及相应科学实验的思维方式和创新能力。