急性颅脑损伤患者外周血Th17/Treg 细胞及相关细胞因子表达及意义

刘飞飞 韩丽君 鲍光明 李 军

急性颅脑损伤是神经外科常见疾病之一。研究表明，急性颅脑损伤后的免疫炎性反应在继发性脑损伤中发挥重要作用[1]。研究发现，Th17/Treg 细胞失衡与自身免疫性疾病[2]、脑出血[3]、脑梗死[4]、脑动脉瘤[5]和帕金森病[6]等多种疾病关系密切，急性颅脑损伤可导致白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、转化生长因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）等细胞因子的异常表达[7]。然而，目前关于Th17/Treg 细胞平衡与急性颅脑损伤程度关系的研究仍较少。因此，本研究通过观察不同程度急性颅脑损伤患者及健康体检者外周血Th17/Treg 细胞比例差异，并检测血清相关细胞因子IL-17、IL-23、TGFβ1 表达水平，探讨Th17/Treg 细胞平衡与急性颅脑损伤的关系，为急性颅脑损伤的病情评估及预后判断提供参考。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集2015 年1 月—2016 年12 月在杭州市中医院神经外科住院治疗的104 例急性颅脑损伤非手术患者作为研究对象。格拉斯哥昏迷量表（Glasgow coma scale，GCS）评分由两位有经验的神经外科医师判定，根据GCS 评分量表进行分组[8]：GCS13～15 分为轻型颅脑损伤组34 例，GCS9～12 分为中型颅脑损伤组38 例，GCS3～8 分为重型颅脑损伤组32 例，另选取同期在杭州市中医院体检中心体检的健康人30 名为对照组。本研究经医院伦理委员会审核通过，所有参与者受试前均签署知情同意书。

1.2 诊断标准 急性颅脑损伤诊断参照《临床诊疗指南神经外科学分册》[9]及文献[10]诊断标准：（1）患者因外伤导致颅脑损伤；（2）入院时间不超过外伤发生后12h；（3）头颅CT 和（或）核磁共振等影像学检查提示点片状高密度影，或者高、低密度影相兼。

1.3 纳入及排除标准 纳入标准：（1）年龄18～75岁；（2）所有患者均符合上述诊断标准，且伤后6h 内来院就诊；（3）GCS 评分3～15 分。排除标准：（1）伤前明确有免疫疾病或严重感染者；（2）妊娠及哺乳期者；（3）近8 周内服用过免疫抑制剂者；（4）合并其他脏器严重损伤，或合并有严重基础性疾病（如心、肺、肝、肾功能异常者）。

2 方 法

2.1 标本采集 各组颅脑损伤患者入院后次日清晨抽取空腹静脉血8mL 于肝素钠抗凝管中，对照组血液标本由我院体检中心提供。其中3mL 静脉血，3000r/min 离心10min，取上层血清置-80℃冰柜冷冻保存待用于EILSA 检测。另5mL 静脉血用Ficoll 密度梯度离心后分离外周单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用于 流 式 细胞 术 检 测Th17 细胞、Treg 细胞。

2.2 外周血Th17 细胞、Treg 细胞检测 流式细胞术的检测参考文献，使用Beckman coulter cell 多色流式细胞仪，以CD4+IL-17+代表Th17 细胞，以CD4+CD25+Foxp3+代表Treg 细胞，分析Th17 细胞和Treg细胞的含量。流式分析相关抗体均购自美国BD 公司。

2.3 血清IL-17、IL-23、TGF-β1 表达水平测定 按人IL-17、IL-23、TGF-β1 ELISA 试剂盒说明书进行操作（上海蓝基生物科技有限公司，批号20161010）。在450nm 处测定各标本OD 值，以OD 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，根据标准曲线计算出各样品IL-17、IL-23、TGF-β1 表达水平。

2.4 统计学方法 应用SPSS19.0 软件对数据进行统计分析处理。计量资料以均数±标准差（±s） 表示，计量资料如符合正态分布多组间比较采用单因素方差分析，若差异有显著性，组间两两比较采用LSD-t检验，如不符合正态分布或方差不齐采用非参数检验，取双侧检验。计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 四组一般资料比较 轻型颅脑损伤组34 例，男18 例，女16 例，年龄为26～74 岁，平均（48.06±13.08）岁；中型颅脑损伤组38 例，男20 例，女18 例，年龄29～73 岁，平均（49.81±14.48）岁；重型颅脑损伤组32 例，男17 例，女15 例，年龄25～75 岁，平均（47.34±12.99）岁；对照组30 名，男15 名，女15 名，年龄24～72 岁，平均（46.23±13.71）岁。四组性别、年龄等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

3.2 各组外周血Th17 细胞、Treg 细胞百分率比较急性颅脑损伤患者外周血Th17 细胞百分率高于对照组（P＜0.05），重型颅脑损伤组明显高于轻型和中型颅脑损伤组（P＜0.05），中型颅脑损伤组明显高于轻型颅脑损伤组（P＜0.05）；中重型颅脑损伤患者外周血Treg 细胞百分率低于对照组（P＜0.05），重型颅脑损伤组低于轻型和中型颅脑损伤组（P＜0.05），中型颅脑损伤组低于轻型颅脑损伤组（P＜0.05）。与对照组比较，轻型颅脑损伤患者外周血Treg 细胞百分率降低不明显（P＞0.05），见表1。

表1 健康对照者与急性颅脑损伤患者外周血Th17 细胞、Treg 细胞百分率比较（%，x±s）

3.3 各组血清IL-17、IL-23、TGF-β1 表达水平比较

急性颅脑损伤患者血清IL-17、IL-23 水平均高于对照组（P＜0.05），重型颅脑损伤组高于轻型和中型颅脑损伤组（P＜0.05），轻型颅脑损伤组的IL-17、IL-23 水平最低；中重型颅脑损伤患者血清TGF-β1 水平低于对照组（P＜0.05），重型颅脑损伤组低于轻型和中型颅脑损伤组（P＜0.05），中型颅脑损伤组低于轻型颅脑损伤组（P＜0.05）。与对照组比较，轻型颅脑损伤患者血清TGF-β1 水平降低不明显，见表2（P＞0.05）。

表2 健康对照者与急性颅脑损伤患者血清IL-17、IL-23、TGF-β1 表达水平比较（pg/mL，x±s）

4 讨 论

研究证实，急性颅脑损伤后的血脑屏障破坏、炎性反应、自由基损伤等可加重神经功能受损，从而导致继发性脑损伤[12]。其中免疫炎性反应在急性颅脑损伤中的作用尤为重要。Treg 细胞作为内源性负性免疫调节细胞可减轻脑缺血后再灌注损伤、抑制脑出血后免疫炎性反应，对脑细胞起到保护作用[13-14]。有学者发现，蛛网膜下腔出血、颅内动脉瘤破裂和脑疝均导致患者血清Treg 细胞含量降低[15]。Th17/Treg 细胞在人体中相对平衡，在维持机体的免疫平衡状态中发挥重要作用。但当机体出现脑梗死、帕金森或自身免疫疾病等情况时，Th17/Treg 细胞的平衡被打破，造成人体细胞因子网络的动态平衡被破坏，进而引起疾病的发生和发展[16]。

本研究结果显示，急性颅脑损伤患者外周血Th17 细胞水平明显高于对照组，且脑损伤程度越重其升高越明显；而急性颅脑损伤患者外周血中Treg细胞水平低于对照组，且重型颅脑损伤患者降低最明显。该结果表明，Th17 过亢及Treg 不足可能与急性颅脑损伤后的脑损伤程度相关，Th17/Treg 细胞失衡参与急性颅脑损伤后继发性脑损伤的过程。

IL-17 是Th17 细胞介导炎性损伤的主要致炎因子，具有募集、动员与活化中性粒细胞的能力，可以促进LI-6、IL-8 等细胞因子释放，诱导机体发生免疫损伤[17]。IL-23 能够增强Th17 细胞的增殖，维持Th17 细胞稳定, 并刺激其相关细胞因子IL-17、IL-6和IL-8 的分泌[18]。IL-23/IL-17 轴通过介导异常免疫炎性反应，在急性脑出血[19]、肿瘤[20]、脑梗死[21]和自身免疫性疾病[22]等多种疾病中发挥作用。TGF-β1 属于重要的抗炎因子，可促使Treg 细胞分化，在Treg 细胞增殖过程中发挥作用。TGF-β1 能够调节中枢神经系统的炎症反应和小胶质细胞的增殖、促进细胞修复和血管生成，具有脑保护的作用[23]。

本研究结果发现，急性颅脑损伤患者外周血IL-17、IL-23 水平较对照组明显升高，且脑损伤程度越重其升高越明显，表明IL-23/IL-17 轴参与急性颅脑损伤的发病；而急性颅脑损伤患者外周血TGF-β1水平较对照组降低，且重型颅脑损伤患者降低最明显。以上结果进一步证实促炎因子表达增多及抑炎因子表达不足可能与急性颅脑损伤后的脑损伤程度相关。

综上所述，Th17/Treg 细胞及其相关细胞因子是免疫炎性反应的重要效应因子，Th17/Treg 细胞失衡参与急性颅脑损伤后继发性脑损伤过程。检测Th17/Treg 细胞及其相关细胞因子水平有助于评估急性颅脑损伤患者病情。