独活对巨噬细胞迁移抑制因子抑制作用的有效成分虚拟筛选研究

李江 夏鹏 曹必伟 徐建果

摘要：目的  篩选独活对巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）抑制作用的有效成分，为独活治疗炎症和免疫介导疾病的作用机制研究及MIF抑制剂研发提供参考。方法  以中国台湾中医药资料库中独活有效成分小分子化合物为对接配体库、MIF晶体结构为对接受体进行分子对接，筛选结合能高于原配体的小分子。对结合后的复合物构像进行相互作用分析，选取最佳配体小分子与大分子复合物进行10 ns的动力学模拟，分析均方根偏差（RMSD）值。操作平台为Linux系统，采用OpenBabelGUI2.4.1进行小分子修饰，Pyrx0.8进行虚拟筛选，NAMD2.13进行分子动力学模拟，VMD1.9.3、Discovery studio4.5及Ligplot+1.4.5进行对接结果及动力学模拟结果分析。结果  筛选出优于原配体的独活有效成分4种，分子相互作用分析提示主要作用残基8个，主要作用力为氢键及疏水作用，动力学模拟结果表明最佳配体小分子与受体结合较稳定。结论  本研究提示独活抗炎作用机理可能与抑制MIF活性有关，其抑制作用有效成分主要有4种，可为研究和设计MIF抑制剂提供参考。

关键词：巨噬细胞迁移抑制因子;独活;抑制剂;虚拟筛选;分子动力学模拟

中图分类号：R2-05;R285    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）05-0105-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.022 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Objective To screen the active components of Angelicae Pubescentis Radix for inhibiting MIF; To provide references for the study on the mechanism of inflammatory and immune-mediated diseases and the development of MIF inhibitors. Methods Using the small molecule compound of the active components in the TCM database of Taiwan as a docking ligand library， the MIF crystal structure was the acceptor for molecular docking， and small molecules with higher binding energy than the original ligand were screened. The interaction analysis of the combined complex conformation was carried out， and the optimal ligand small molecule and macromolecular complex were selected for 10 ns kinetic simulation to analyze the root mean square deviation （RMSD） value. The operating platform was Linux system. OpenBabelGUI2.4.1 was used for small molecule modification， Pyrx0.8 for virtual screening， NAMD2.13 for molecular dynamics simulation， VMD1.9.3， Discovery studio4.5 and Ligplot+1.4.5 for docking results and dynamics simulation results analysis. Results Four active components were screened out， which were superior to the original ligand. Molecular interaction analysis indicated that there were 8 main action residues， and main force was hydrogen bonding and hydrophobic interaction. Kinetic simulation results showed that the binding of small molecules of the best ligand to the receptor was stable. Conclusion It is indicated that the anti-inflammatory mechanism of Angelicae Pubescentis Radix may be related to the inhibition of MIF activity. There are four main active components of Angelicae Pubescentis Radix， which can provide references for the study and design of MIF inhibitors.

Keywords： MIF; Angelicae Pubescentis Radix; inhibitors; virtual screening; molecular dynamics simulation

巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一类多效性的前炎症因子，能激活转录因子，促进其他各类前炎症因子的表达，同时，能直接刺激固有细胞内前炎症因子库的释放，引发炎症反应，并创造以前炎症因子为主的炎性微环境[1]。MIF与许多炎症和免疫介导的疾病有关，如全身性血管炎、系统性红斑狼疮和类风湿关节炎（RA）等。临床研究表明，MIF与RA发病密切相关，其抑制结合位点是非常有希望的药物作用靶点[2]。MIF晶体结构最早于1996年被Sun等解析[3]，为由3个相同亚基组成的桶状结构的三聚体，催化活性中心位于相邻亚基之间。

RA是以慢性、对称性多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现的疾病。目前西医治疗尚无特效方法，且长期服药不良反应较大。中医药在防治RA方面疗效较好[4]。但中药有效成分较为复杂，药物作用机制难以阐明。随着生物信息学和计算机辅助药物设计等学科的发展，药物与靶标作用机制能以更直观的方式呈现。独活是重要的祛风湿药，《本草汇言》载“独活，善行血分，祛风行湿散寒之药也”。本研究使用小分子虚拟筛选与分子动力学模拟等技术探索独活中MIF抑制剂小分子，以探究独活治疗RA等疾病的作用机理。

1  资料与方法

1.1  操作平台与软件

操作平台为Linux系统，采用OpenBabelGUI2.4.1进行小分子修饰，Pyrx0.8进行虚拟筛选，NAMD2.13进行分子动力学模拟，VMD1.9.3、Discovery studio4.5及Ligplot+1.4.5进行对接结果及动力学模拟结果分析。

1.2  独活小分子数据库建立

独活小分子数据来源于中国台湾中医药资料库TCM Database@Taiwan（http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/ index.php）。该数据库是目前全世界最大的可直接用于虚拟筛选和分子动力学模拟的中医药小分子数据库，含中药443种、中药小分子化合物2万多种。该数据库可提供中药成分查询，或已知某种成分，查询含有该成分的中药。进阶查询提供以结构为基础的查询，使用者可在线画出要查询的主结構，再输入限制条件，如分子量、分子体积、Log P、氢键接受体数目等，进行复合式查询[5]。

建立独活小分子数据库。下载独活有效成分小分子mol2文件后使用OpenBabelGUI2.4.1软件将其转换为sdf文件等待对接。

1.3  受体蛋白数据建立

从RCSB PDB数据库搜索MIF蛋白结构信息，选择人源型、鉴定方法为X射线衍射法、分辨率>2.6 ?的结构。最终确定PDB ID为1LJT的蛋白晶体结构为对接受体蛋白。该蛋白结构含MIF蛋白与3个配体小分子，每个配体小分子镶嵌在2个亚基之间。使用Discovery studio软件将蛋白与配体小分子分离后另存为单独pdb文件，然后计算小分子的结构中心数据并保存。使用Pyrx软件导入分离后的受体与配体结构并转存为对接文件，设置对接中心为配体中心，对接半径为5?，Exhaustion参数设为8，运行Autodock Vina对接模块。对接结束后选择Binding Affinity第一的结果并使用VMD计算该结果与原配体的均方根偏差（RMSD）值，得出RMSD=1.14 ?，提示原配体可较好地还原到对接口袋中，设置的对接参数合理[6]。

1.4  独活小分子成分虚拟筛选

将收集到的独活小分子导入Pyrx并进行能量优化，然后保存为对接小分子。再次使用Vina程序将包括原配体小分子在内的所有小分子与MIF大分子受体进行对接，其中原配体作为阳性对照小分子，对接参数为原参数。对接结束后按Binding Affinity能量值由低到高排序，选取能量低于原配体的小分子并单独保存为pdb文件。将得到的小分子分别还原到结合口袋中，分别使用Discovery studio软件和Ligplot+[7]软件分析小分子与受体相互作用关系三维与二维构像图，并分析主要作用残基和作用力。

1.5  分子动力学模拟

使用NAMD[8]对对接能量最低的小分子与受体的复合体结构进行10 ns分子动力学模拟，观察复合物的稳定性。首先分析小分子结构并编写相应的拓扑文件与力场参数文件，再将复合物加入立方体水盒子中，同时加入平衡离子使整体电荷为中性，平衡离子为NaCl，并生成psf文件。浸入水盒子的复合物模型构建完成后先进行1000步（Timestep）的能量优化，然后再进行动力学模拟。模拟中使用的力场主要为CHARMM力场，时间步长设置为2 fs，其他参数设为默认值，模拟结束后分析RMSD值。

2  结果

2.1  分子对接结果

本研究从数据库下载独活有效成分小分子84个，对接结束后得到结合能低于原配体的小分子4个，其结合能与结构信息见表1。结果显示原配体结合能为-8.3 kcal/mol，高于其结合能的4个小分子共有7种结合构像，其中排名第二的小分子（Z）-3-（6-Hydroxy- 1-benzofuran-5-yl）acrylaldehyde共有4种。而亲和力最高的为（Z）-3-[（R）-6-Hydroxy-2-isopropyl-2，3-dihydro- 1-benzofuran-5-yl]acrylaldehyde小分子，其结合能为-9.4 kcal/mol。

2.2  相互作用分析

排名第二的小分子有4种构像，仅显示结合能较小的构像。小分子在受体蛋白中结合位点见图1。可以看出，4个小分子均镶嵌到了MIF蛋白2个亚基之间的连接处，结合较紧密。

小分子与蛋白作用残基三维与二维结构见图2、图3。相互作用残基表明，产生疏水作用残基主要为TYR36、TYR95、PHE113、VAL106、MET101、ILE64、LYS32、PRO1，正静电势主要在LYS32残基附近。序号1小分子与ILE64上的N原子和LYS32上的NZ原子形成氢键，键长分别为3.10 ?和2.92 ?。序号2小分子与LYS32上的NZ原子形成氢键，键长为2.92 ?。氢键是维系蛋白质与配体分子稳定性的重要作用力，一般氢键的键能为2～8 kcal/mol，不同原子的键能不同。提示序号1与序号2的结合能差别主要在于氢键。

2.3  分子动力学模拟

能量优化结果见图4，在1500 fs时能量基本达最低值，提示能量优化较彻底，优化后的结构可进行动力学模拟。

复合物RMSD值波动图见图5，其均值为（1.53±0.18）?。约5 ns后整个复合物趋于稳定，无较大波动，提示小分子与MIF结合后较稳定。

3  结论

本研究使用药物虚拟筛选技术对单味中药独活小分子化合物进行虚拟筛选，最后得到4种优于原MIF晶体结构中配体的小分子化合物，对接后的小分子均镶嵌在MIF 2个相邻亚基间的活性口袋中。分子相互作用分析结果表明，主要的结合作用力为氢键和疏水作用，主要作用残基有8个。对筛选出来的最佳小分子与受体结合后的模型进行分子动力学模拟，发现受体与配体能稳定结合，提示独活基于MIF抑制剂的有效抗炎活性成分可能为（Z）-3-[（R）-6-Hydroxy-2- isopropyl-2，3-dihydro-1-benzofuran-5-yl]acrylaldehyde小分子。本研究探索了独活在抑制MIF活性中的作用机理，可为进一步阐释独活治疗炎症和免疫介导疾病的作用机制研究及设计研发MIF抑制剂提供参考。

参考文献：

[1] DAS R， KOO M S， KIM B H， et al. Macrophage migration inhibitory factor（MIF） is a critical mediator of the innate immune response to Mycobacterium tuberculosis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013， 110（32）：2997-3006.

[2] MANGANO K， MAZZON E， BASILE M S， et al. Pathogenic role for macrophage migration inhibitory factor in glioblastoma and its targeting with specific inhibitors as novel tailored therapeutic approach[J]. Oncotarget，2018，9（25）：17951-17970.

[3] SUN H W， BERNHAGEN J， BUCALA R， et al. Crystal structure at 2.6-angstrom resolution of human macrophage migration inhibitory factor[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93（11）：5191-5196.

[4] 邱明山，张倩，陈进春，等.中西医结合治疗活动性类风湿关节炎疗效与安全性评估[J].中国中医药信息杂志，2016，23（1）：31-34.

[5] CHEN C Y. TCM Database@Taiwan：the world's largest traditional Chinese medicine database for drug screening in silico[J]. PLoS One，2012，6（1）：15939.

[6] GOHLKE H， HENDLICH M， KLEBE G. Knowledge-based scoring function to predict protein-ligand interactions[J]. Journal of Molecular Biology，2000，295（2）：337-356.

[7] LASKOWSKI R A， SWINDELLS M B. LigPlot+：multiple ligand-protein interaction diagrams for drug discovery[J]. J Chem Inf Model， 2011，51（10）：2778-2786.

[8] MELO M C R， BERNARDI R C， RUDACK T， et al. NAMD goes quantum：an integrative suite for hybrid simulations[J]. Nat Methods，2018， 15（5）：351–354.

（收稿日期：2018-11-03）

（修回日期：2018-11-22;編辑：向宇雁）