Epstein Barr病毒编码的microRNA bart7调节鼻咽癌放疗敏感性的机制

彭先兵,戴润芝

(十堰市人民医院,湖北医药学院附属人民医院耳鼻喉科,十堰 442000;*通讯作者,E-mail:pengxianbin1@126.com)

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染与鼻咽癌的发生发展有一定相关性[1-3]。鼻咽癌细胞产生的microRNA包括两类:由宿主细胞基因组产生的microRNA;由EBV基因组产生的microRNA,此类microRNA是由Bam HIA区编码,将其命名为bart microRNAs。bart microRNAs可分泌至细胞外,研究人员在鼻咽癌种植瘤裸鼠的外周血以及细胞培养液中均发现了多种bart microRNAs的高水平表达,并提出microRNA bart7在其中表达量最高[4,5]。相较于非鼻咽癌人群,鼻咽癌患者血浆microRNA bart7水平增加,推断microRNA bart7水平与鼻咽癌发生密切相关。目前针对EBV以及microRNA bart7的研究主要集中在鼻咽癌的诊断方面[6,7],关于治疗的监测以及放疗敏感性方面的研究尚不多见。本研究以鼻咽癌患者为研究对象,探讨血浆EBV/DMA表达水平不同对其放疗敏感性的影响,并从其编码的microRNA bart7方面进一步分析其影响机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究选取2017-03～2017-10期间我院收治的75例鼻咽癌患者以及同期入院体检的30例健康人群为研究对象。入组标准:①符合诊断标准的鼻咽癌患者[8];②首次接受治疗者;③卡氏(KPS)评分>60分者;④随访资料完整者。排除标准:①术前检查发现罹患有严重糖尿病、高血压者;②合并神经系统疾病、心血管系统疾病者;③肝炎、结核等病史;④合并其他恶性肿瘤患者。本研究已经获得医院医学伦理委员会批准,且受试者均已签署书面知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 荧光定量PCR技术检测健康人群以及放疗前、后鼻咽癌患者血浆EBV/DNA阳性 ①提取DNA:全部受试者各取2 ml外周血,置于EDTA抗凝管内,采用低温高速离心机进行离心,取血浆保存于-20 ℃冰箱中待测;取出待测血浆于4 ℃条件下解冻,向待测标本管内加入50 μl DNA提取液(上海生工生物工程股份有限公司),操作方法严格按照DNA提取试剂盒说明进行。②荧光定量PCR:目的基因为EBV/DNA的EBNA-1片段,正向引物:5′-GTAGAAGGCCATTTTTCCAC-3′;反向引物:5′-TTTCTACGTGACTCCTAGCC-3′。双荧光标记探针序列为:5′-(FAM)ACCACCGTGGCCCAGATGG(TAMRA)-3′。荧光定量PCR反应条件如下:93 ℃,2 min,1次循环;93 ℃ 45 s,55 ℃ 60 s,10次循环;93 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s,30次循环。荧光定量PCR试剂盒及荧光定量PCR仪购自上海生工生物工程股份有限公司,检测步骤、质控方法以及结果判读严格按照说明书进行。检测临界值为5×102copies/μl,EBV/DNA阳性及检测结果≥5×102copies/μl。

1.2.2 实时荧光定量PCR技术检测放疗前、后鼻咽癌患者血浆中microRNA-BART7表达 ①RNA提取与逆转录反应:全部受试者各取400 μl血浆,采用mir Vanami RNA提取试剂盒(Ambion,Austin,Tex)提取血浆总RNA,操作方法严格按照试剂盒说明进行。取40 ng RNA样本,逆转录反应采用TaqMan microRNA检测试剂盒(AppliedBiosystems,FosterCity,Calif)进行,特异性茎环引物与探针按照miRBase数据库中搜集的成熟EBV-miRNAs进行设计。②实时荧光定量PCR:目的片段来自EBV-miRNAs成熟体,内参为RNU6B。为提升血浆中miRNA丰度,首先采用TaqMan Pre Amp Master Mix(Applied Biosystems)对其进行预扩增,反应条件如下:50 ℃ 3 min、95 ℃ 10 min,12次循环95 ℃ 15 s,60 ℃ 2 min。以1 ∶2的比例对预扩增产物进行稀释,20 μl miRNA反应体系如下:稀释产物5 μl,热启动Taq聚合酶8 U,dATP、dGTP、dUTP、dCTP各200 μmol,10×Realtime PCR缓冲液2 μl,引物5 pmol,探针5 pmol。采用ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增。反应条件:95 ℃处理10 min后热启动;94 ℃处理2 min后完成变性;93 ℃下处理40 s,56 ℃处理45 s,4 ℃处理30 min,如此循环35次。

1.2.3 酶联免疫吸附(ELISA法)测定EBV相关肿瘤标志物表达水平 血清EBV VCA-IgA、EA-IgA、Rta-IgG分别采用抗EBV衣壳抗原抗体Ig A试剂盒、抗EBV早期抗原IgA抗体试剂盒以及EBV Rta蛋白抗体IG试剂盒进行测定,检测试剂盒均购自同昕生物技术(北京)有限公司。EBV VCA-IgA、EA-IgA表达检测按照1 ∶100的比例加入样本缓冲液稀释血清标本,Rta-IgG表达检测按照1 ∶9的比例加入样本缓冲液稀释血清标本,分别于微孔内加入稀释后的样本、阳性对照以及阴性对照各100 μl,室温条件下温育30 min,采用洗板机(奥地利,型号:anthosfruido)进行洗板,显色终止后采用anthos 2010型酶标仪测定光密度值。EBV VCA-IgA、EA-IgA阳性判定标准为S/CO≥0.8,Rta-IgG阳性判定标准为S/CO≥1。

1.3 统计学分析

本研究中数据全部采用SPSS20.0统计分析软件(美国IBM公司)进行处理;计数资料采用率(%)表示,组间比较采用χ2分析;利用相关性分析探究EBV/DNA阳性检出率与microRNA-BART7、EBV VCA-IgA、EA-IgA、Rta-IgG阳性检出率之间的相关性;P<0.05代表差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌患者与健康人群血浆EBV/DNA阳性率比较

健康人群、鼻咽癌患者中EBV/DNA阳性患者数分别为1例和69例,鼻咽癌患者血浆EBV/DNA比率高于健康人群(92.00%vs3.33%),且差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

2.2 鼻咽癌患者放疗前后血浆EBV/DNA阳性率比较

放疗前、放疗后鼻咽癌患者中EBV/DNA阳性患者数分别为69例和23例,放疗后鼻咽癌患者血浆EBV/DNA阳性率低于放疗前(30.67%vs92.00%),且差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表1 鼻咽癌患者与健康人群血浆EBV/DNA阳性率比较 例(%)Table 1 Comparison of plasma EBV/DNA positive rate between nasopharyngeal cancer patients and healthy subjects cases(%)

表2 鼻咽癌患者放疗前后EBV/DNA阳性率比较 例(%)Table 2 Comparison of EBV/DNA positive rates in nasopharyngeal cancer patients before and after radiotherapy cases(%)

2.3 不同放疗效果鼻咽癌患者血浆EBV/DNA阳性率比较

放疗后持续缓解、复发/转移的鼻咽癌患者中EBV/DNA阳性患者数分别为3例和20例,放疗后持续缓解的鼻咽癌患者血浆EBV/DNA阳性率低于复发/转移者(12.50%vs39.22%),且差异有统计学意义(P<0.05,见表3)。

表3 不同放疗效果鼻咽癌患者血浆EBV/DNA阳性率比较 例(%)Table 3 Comparison of positive rates of plasma EBV/DNA in nasopharyngeal carcinoma patients with different radiotherapy effects cases(%)

2.4 鼻咽癌患者放疗前后EBV相关肿瘤标志物阳性率比较

放疗前,鼻咽癌患者血浆microRNA bart7、EBV VCA IgA、EBV EA IgA、EBV Rta IgG阳性率均低于放疗前,且差异有统计学意义(P<0.05,见表4)。

2.5 不同放疗效果鼻咽癌患者EBV相关肿瘤标志物阳性率比较

放疗后,持续缓解的鼻咽癌患者血浆microRNA bart7、EBV VCA IgA、EBV EA IgA、EBV Rta IgG阳性率均高于持续缓解者,且差异有统计学意义(P<0.05,见表5)。

表4 鼻咽癌患者放疗前后EBV相关肿瘤标志物阳性率比较 例(%)Table 4 Comparison of positive rate of EBV-related tumor markers in nasopharyngeal cancer patients before and after radiotherapy cases(%)

表5 不同放疗效果鼻咽癌患者EBV相关肿瘤标志物阳性率比较 例(%)Table 5 Comparison of positive rates of ebv-related tumor markers in nasopharyngeal cancer patients with different radiotherapy effects cases(%)

2.6 EBV/DNA阳性率与EBV相关肿瘤标志物阳性率的相关性分析

EBV/DNA阳性率与microRNA bart7阳性率呈正相关(r=0.461,P<0.05),未发现EBV/DNA阳性率与EBV VCA IgA、EBV EA IgA、EBV Rta IgG等肿瘤标志物之间的相关性(P>0.05,见表6)。

表6 EBV/DNA阳性率与EBV相关肿瘤标志物水平的相关性分析Table 6 Correlation between EBV/DNA positive rate and EBV related tumor markers

3 讨论

放疗是治疗鼻咽癌的主要方式,患者治疗失败的主要原因为局部或区域复发以及远处转移。约有40%-50%完全缓解的患者后期可能会发生复发或转移,造成治疗失败。目前临床中诊断鼻咽癌患者治疗后复发或转移的方式效果不佳。研究证实[9,10],鼻咽癌患者血浆EBV/DNA水平能够对可以肿瘤负荷进行准确反应,随着肿瘤的清除而EBV/DNA水平可在短期内降低至低于检测极限值,由此可以推断,鼻咽癌患者治疗后在血浆检测到EBV/DNA则可能意味着已经发生了复发或转移[11]。本研究中,鼻咽癌患者血浆EBV/DNA阳性率为92.00%,而健康人群中血浆EBV/DNA均为阴性,再次证实EBV/DNA与鼻咽癌的发生发展密切相关。本研究还发现,放疗后鼻咽癌患者血浆microRNA bart7、EBV VCA IgA、EBV EA IgA、EBV Rta IgG阳性率均低于放疗前(P<0.05)。放疗后,持续缓解的鼻咽癌患者血浆microRNA bart7、EBV VCA IgA、EBV EA IgA、EBV Rta IgG阳性率均低于复发/转移者。EBV/DNA阳性率与microRNA bart7阳性率呈正相关。这说明通过化疗可有效降低EBV/DNA水平,且通过检测EBV/DNA水平能够对患者放疗的不同效果进行有效区分。故对于检测结果为EBV/DNA阳性者,应进行进一步的临床与影像学检查,以评估患者是否发生肿瘤复发或远处转移。相较于EBV/DNA阴性患者来说,EBV/DNA阳性者在短期内发生疾病进展的风险较高,医护人员应对此类患者进行密切观察,应提醒患者注意定期入院复查以实现早发现早治疗的目的[12,13]。EBV bart microRNAs由对宿主细胞进行潜伏感染的EBV基因组进行编码,bart microRNAs的主要特点包括[14-16]:bart microRNAs在鼻咽癌中表达较高,而在EBV感染的其他肿瘤中水平则较低;bart microRNAs在鼻咽癌患者癌旁组织以及正常鼻咽黏膜中均不表达,仅在在鼻咽癌组织中高表达;细胞中bart microRNAs表达水平与鼻咽癌细胞分泌且进入exosome的表达水平较为一致。鼻咽癌细胞所分泌的bart microRNAs可进入血液循环,并与肿瘤组织中的表达水平有一定的相关性。在多种EBV感染的细胞株以及培养液中存在microRNA bart7的高表达,证实microRNA bart7能够分泌至细胞外,并呈现较高的表达水平[17,18]。

本研究还显示,鼻咽癌患者放疗前microRNA bart7高表达,而放疗后则下降,且放疗后持续缓解的鼻咽癌患者血浆microRNA bart7阳性率低于复发/转移。由此可以推断存活的鼻咽癌细胞可能将microRNA bart7分泌至血液[19,20]。鼻咽癌患者放疗后,存活细胞的残留情况对患者治疗方案的选择来说尤为重要。本研究说明鼻咽癌患者放疗后肿瘤残留情况血浆microRNA bart7表达水平相关,其原因是放疗后,肿瘤复发或转移的鼻咽癌患者存活的鼻咽癌细胞数量高于放疗后缓解者。因此,监测血浆miRNA-BART7表达水平有利于反映鼻咽癌患者放疗后疾病进展情况。即miRNA-BART7可能是由存活的鼻咽癌细胞分泌至血液。鼻咽癌放疗结束时,判断是否还残留一定量的存活细胞对临床上制定放疗后的治疗方案至关重要。miRNA-BART7浓度与肿瘤负荷相关,且鼻咽癌放疗结束时血浆miRNA-BART7表达水平与肿瘤残留相关。此外,当肿瘤体积巨大时时,放疗后血浆miR-BART7下降到<50拷贝数以下的概率微小。可能是因为肿瘤体积巨大者,放疗结束后肿瘤无法达到完全缓解,即仍存在一定数目的存活鼻咽癌细胞,提示血浆miRNA-BART7是监测鼻咽癌治疗疗效和早期发现复发、转移的潜在指标。

综上所述,放疗后持续缓解的鼻咽癌患者血浆EBV/DNA、microRNA bart7阳性率低于复发/转移者,EBV可能通过调节其编码的microRNA bart7水平对鼻咽癌患者放疗敏感性产生影响,故临床中可通过测定血浆microRNA bart7水平预测患者放疗效果。