肝癌组织中LIV-1基因mRNA的表达及意义

吴文婧,韩少山,陈 葳,李 旭,赵 乐*

(1 西安交通大学第一附属医院检验科,西安 710061;2 西安交通大学第一附属医院肝胆外科;3 西安交通大学第一附属医院转化医学中心;4 西安交通大学第一附属医院陕西省肿瘤精准医学重点实验室;*通讯作者,E-mail:zhaole2@mail.xjtu.edu.cn)

最新的癌症统计数据显示,2018年肝癌在全球的新发病例预计为84万例,居癌症发病率的第六位,死亡病例为78万例,致死率居癌症死亡率的第四位[1]。目前对肝癌的诊断主要依靠血清标志物AFP检测和影像学检测,部分患者确诊时已到晚期,而晚期患者治疗措施有限、效果不佳。为改善患者预后,亟需寻找新的肝癌早期诊断标志物和治疗靶点。

锌离子转运体蛋白LIV-1(又称为SLC39A6或ZIP6)在乳腺癌、前列腺癌、食道癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤中异常高表达[2-5],通过促进上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与肿瘤的进展和转移。但报道肝癌中LIV-1表达水平的研究较少[6]。本研究通过分析TCGA数据库肝癌数据集中LIV-1的表达以及预后分析,并采用逆转录PCR方法来验证LIV-1在肝癌组织中的表达,以探讨LIV-1基因在肝癌进展过程中的作用,并通过启动子区甲基化分析来探讨LIV-1基因在肝癌中表达改变的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 收集2017-01～2018-01西安交通大学第一附属医院收治入院的23例肝癌患者手术切除的肝癌组织和癌旁组织,经病理证实均为肝细胞肝癌。患者手术前均未经过放化疗治疗。患者年龄36-68岁,平均年龄(52 ±12)岁。

1.1.2 主要试剂 Trizol试剂购自Invitrogen,反转录试剂盒为PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大连)。PCR试剂为北京天为时代科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix,DEPC为Amresco产品。氯仿、异丙醇和无水乙醇购自西安化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 LIV-1基因在TCGA数据库中表达分析 利用UALCAN在线分析工具[7](http://ualcan.path.uab.edu/index.html)对TCGA数据库中肝癌数据进行基因表达分析。在网站主页输入目的基因LIV-1,选择肝癌组织,获得目的基因LIV-1在肝癌组织和正常组织中的差异表达,并根据肝癌组织的不同病理分级、临床分期分析LIV-1的表达差异。

1.2.2 生存分析 利用Kaplan Meier Plotter数据(http://kmplot.com/analysis/)中的肝癌数据集进行在线生存分析[8]。该数据来源于TCGA数据库。

1.2.3 逆转录PCR(RT-PCR)检测LIV-1 mRNA的相对表达水平 取液氮保存的组织标本100 mg于液氮中,加入1 ml Trizol研磨,按Trizol试剂使用说明提取总RNA,按反转录试剂盒使用说明将总RNA反转录为cDNA,随后进行PCR扩增。PCR反应条件为:94 ℃ 5 min,之后94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s进行28个循环,最后72 ℃延伸7 min。以GAPDH为内参照,RT-PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳,出现目的大小的扩增条带者为表达阳性,用凝胶成像分析仪Genetools软件分析各扩增条带产物的灰度值,用LIV-1/GAPDH的比值表示LIV-1 mRNA的相对表达水平。PCR引物由TaKaRa公司设计合成。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Sequences of RT-PCR primers

1.3 统计学分析

UALCAN在线数据中不同组间比较采用LSD-t检验。LIV-1在肝癌组织和癌旁组织中的表达差异采用配对t检验。数据采用SPSS19.0进行处理,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LIV-1在TCGA数据库肝癌集中的表达分析

为分析肝癌组织中LIV-1的mRNA水平,我们利用UALCAN在线分析工具对TCGA数据库中的肝癌数据进行基因表达分析。对LIV-1在原发性肝细胞肝癌和正常肝组织中的表达水平的分析发现,LIV-1在肝癌组织中的表达明显高于正常组织(P<0.01,图1A)。进一步分析发现,LIV-1在各期别肝癌组织中的mRNA水平也明显高于正常组织(P<0.01,图1B),但不同分期肝癌组织中的LIV-1 mRNA水平无显著差异(P>0.05)。此外,对不同病理分级的肝癌组织LIV-1 mRNA水平的分析结果显示,相对于正常肝脏组织,LIV-1在不同病理分级的肝癌组织中均呈高表达(P<0.01,图1C),但是各级别的肝癌组织中的表达无明显差异(P>0.05)。

2.2 LIV-1的表达与肝癌患者预后的生存分析结果

来自TCGA数据库的Kaplan-Meier Plotter数据库中的肝癌数据集包含了364例患者的生存数据,根据LIV-1表达水平的高低对患者进行在线生存分析,结果显示,高表达LIV-1的肝癌患者的预后显著劣于低表达患者(P<0.001,见图2)。

2.3 LIV-1在肝癌组织中的表达验证

为验证TCGA数据库肝癌数据集中LIV-1的表达分析结果,我们采用半定量逆转录PCR方法检测了23例肝癌患者的肿瘤组织及癌旁组织的LIV-1 mRNA水平。逆转录PCR结果显示,LIV-1在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,表达水平分别为0.66 ±0.30和0.45 ±0.27,差异具有统计学意义(P=0.002,见图3)。

图1 TCGA数据库肝癌数据集中LIV-1 mRNA水平分析Figure 1 Analysis of LIV-1 mRNA level in liver cancer data set of TCGA database

图2 LIV-1表达与肝癌患者预后的生存分析Figure 2 Survival analysis between LIV-1 expression and prognosis in patients with liver cancer

2.4 LIV-1在肝癌中高表达的机制分析

为了探讨LIV-1在肝癌中异常高表达的可能机制,我们采用生物信息学的方法对LIV-1基因启动子区甲基化水平进行了分析。UALCAN在线分析工具对TCGA数据库肝癌数据集中LIV-1基因启动子区甲基化水平的分析结果显示,肝癌组织中LIV-1基因启动子区的甲基化水平低于正常肝脏组织(P=0.003,见图4),提示肝癌组织中LIV-1水平的升高可能与其启动子区低甲基化有关。

图3 RT-PCR检测的LIV-1在肝癌组织和癌旁组织中的mRNA水平Figure 3 Expression of LIV-1 in liver cancer tissues and paired normal tissues by RT-PCR

3 讨论

原发性肝癌主要包括肝细胞癌(约占75%-85%)和肝内胆管癌(占10%-15%),以及其他少见类型。肝癌在中国的发病率和死亡率分别居第四位和第三位[9],高发病率和死亡率亟需临床寻找新的肝癌诊断预后标志物和治疗靶点。

我们首先采用生物信息学分析方法,发现LIV-1基因在肝癌组织中表达升高,并且在早期肿瘤组织中就能检测到表达的改变,提示LIV-1可能可以作为肝癌的早期诊断标志物。但是生物信息学分析方法具有一定局限性,缺乏相应的实验数据验证。因此我们进一步在临床组织样本中验证了LIV-1基因在肝癌组织中的表达明显高于在配对的癌旁组织中的表达。此外,根据TCGA数据库中生存数据的分析结果,LIV-1高表达可能与肝癌患者的不良预后有关,因此LIV-1可以作为肝癌患者的预后指标来指导临床决策。

图4 LIV-1基因启动子区甲基化水平Figure 4 Promoter methylation analysis of LIV-1 gene

研究表明,LIV-1基因在多种肿瘤中均有表达。Shen等[6]在肝癌细胞HepG2中利用siRNA敲低LIV-1的表达,发现可以明显抑制肝癌细胞的生长和裸鼠成瘤率,并可以上调上皮标志物E-cadherin的表达,提示LIV-1可能是通过促进EMT参与肝癌的进展。我们前期的研究中发现,在宫颈癌HeLa细胞中,LIV-1通过靶向MAPK介导的Snail和Slug的表达来参与宫颈癌细胞的侵袭,其表达下调可以抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、克隆形成能力[5]。我们还发现,LIV-1在宫颈癌组织中表达升高,而在子宫内膜癌中的表达与正常组织相比无明显差异[10],提示LIV-1参与了宫颈癌的发生进展,但是在子宫内膜癌中的意义还需要进一步研究。

LIV-1是锌转运蛋白家族成员之一,也是转录因子STAT3的下游靶点[11]。Sussman等[12]开发了一种抗体-药物复合物(SGN-LIV1A),通过结合LIV-1蛋白的胞外结构域来靶向LIV-1蛋白,用于靶向治疗包括三阴性乳腺癌在内的转移性乳腺癌。该复合物在体外实验和乳腺癌、宫颈癌动物模型体内实验都得到了很好的验证,证明SGN-LIV1A可能可以用于靶向治疗表达LIV-1蛋白的肿瘤患者。而LIV-1在肝癌细胞中高表达,为我们提供一种新思路,可能作为肝癌潜在的治疗靶点。

通过生物信息学手段我们预测LIV-1基因在肝癌细胞中表达升高,其机制可能与其启动子区甲基化水平降低有关,但仍需后续的实验验证。启动子区甲基化水平改变是调控基因表达的重要表观遗传学机制,甲基化水平改变如何影响LIV-1基因在肝癌以及其他肿瘤中的表达还需要进一步的研究。

综上所述,异常高表达的LIV-1基因可能参与了肝癌的进展,是一种预后不良的因素。LIV-1基因启动子区低甲基化可能导致了其异常高表达。