4种检测方法在隐球菌性脑膜炎中的诊断价值

张江峰，张亚丽，王山梅，马 冰，李 轶△

(1.河南省人民医院检验科,郑州 450003；2.郑州大学第二附属医院消化疾病研究所，郑州 450014)

新型隐球菌感染引起的隐球菌性脑膜炎是一种严重的真菌性脑膜炎，具有高患病率和高病死率。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和免疫功能受损是其主要风险因素。全球每年约有100万HIV感染患者罹患隐球菌性脑膜炎，其中死亡患者至少有10万人[1-2]。另外，隐球菌性脑膜炎也可发生于HIV阴性的免疫功能低下患者甚至免疫功能正常的患者。美国一项研究[2]显示，约50%HIV阴性的隐球菌感染患者有中枢神经系统受累。我国有研究[3]显示，HIV阴性的隐球菌性脑膜炎患者病死率高达28.7%。隐球菌性脑膜炎早期缺少特异性的临床表现，误诊率较高。因此，隐球菌性脑膜炎的快速检测及早期诊断是控制感染和预防并发症的关键。本研究应用临床实验室常用的4种隐球菌性脑膜炎的检测方法(墨汁染色法、培养法、胶体金法和乳胶凝集法)进行样本检测，旨在探讨4种方法在隐球菌性脑膜炎中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 病例组为31例经病原学检查(墨汁染色、培养阳性)确诊为隐球菌性脑膜炎病例，均为2014年1月至2018年5月河南省人民医院神经内科和感染科的住院患者，其中男19例，女12例，年龄22～67岁。对照组为同期40例非隐球菌性脑膜炎中枢神经系统感染患者，确诊为结核性脑膜炎、细菌性脑膜炎或病毒性脑膜炎。对照组男23例，女17例，年龄12～71岁。所有的脑脊液标本均为抗真菌药物使用前采集。

1.2仪器与试剂 Bactec FX全自动血培养仪器(美国BD公司)，印度墨汁(北京华越洋DM0103)，CX22显微镜(奥林巴斯)，沙氏培养基(郑州安图公司)，二氧化碳培养箱(日本松下)，隐球菌抗原检测试剂盒(胶体金免疫层析法，美国Immy公司)，隐球菌抗原测定试剂盒(乳胶凝集法，美国Immy公司)，质谱仪[布鲁克(北京)科技有限公司]。

1.3方法

1.3.1直接镜检 墨汁染色选用印度墨汁，将1 mL以上的脑脊液标本3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，取沉渣与墨汁混匀后，加盖盖玻片直接镜检。在黑色背景下，新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，细胞壁明显，有时有出芽现象。

1.3.2培养及鉴定 将脑脊液接种于BD真菌血培养瓶，置于Bactec FX全自动血培养仪进行培养，阳性培养瓶转种沙氏培养基(SDA)37 ℃培养，采用质谱仪进行种的鉴定。

1.3.3乳胶凝集试验 取100 μL的脑脊液样本于100 ℃温箱中孵育5 min，取25 μL的隐球菌抗原阳性对照、阴性对照和预处理的脑脊液标本加在环状玻片的分离环中，并各加入25 μL的隐球菌乳胶进行混合，于室温下手动轻摇5 min后立即观察结果。

1.3.4胶体金法 将脑脊液标本3 000 r/min离心10 min，在反应试管中滴加1滴样本稀释液，取40 μL脑脊液样本加入反应试管中，随后将胶体金试纸条插入反应试管中，室温孵育10 min后进行结果判读。

1.4统计学处理 用SPSS19.0软件进行数据分析，计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1传统方法(墨汁染色法和培养法)检测隐球菌的结果比较 将病例组和对照组患者的脑脊液标本分别采用墨汁染色法直接镜检和直接接种培养法进行检测，病例组脑膜炎患者脑脊液标本检测结果显示：墨汁染色法阳性15例，阳性率为48.4%；培养法阳性25例，6例脑脊液样本培养结果为阴性，阳性率为80.6%。对照组脑膜炎患者脑脊液标本采用两种方法检测结果均为阴性。两种传统方法的阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=7.045，P=0.008<0.05)，见表1。

表1 4种检测方法在各组中的检测结果(n)

2.2隐球菌荚膜多糖抗原检测方法(胶体金法和乳胶凝集法)检测结果比较 病例组胶体金法共检出阳性27例对照组，阴性4例，阳性率为87.1%；乳胶凝集法共检出阳性30例，阴性1例，阳性率为96.8%。采用胶体金法有2例脑脊液样本出现假阳性结果，其余均为阴性结果，采用乳胶凝集法有1例脑脊液样本出现假阳性结果，其余均为阴性结果。两种隐球菌荚膜多糖抗原检测方法的阳性检出率比较差异无统计学意义(χ2=1.958，P=0.354>0.05)，见表1。

2.3不同检测方法的灵敏度和特异性比较 墨汁染色法、培养法、胶体金法和乳胶凝集法的灵敏度分别为48.3%、80.6%、87.1%、和96.8%，特异度分别为100.0%、100.0%、95.0%、和97.5%。比较4种方法的方法学指标(灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值)，结果显示隐球菌荚膜多糖抗原检测方法灵敏度和阴性预测值显著高于传统墨汁染色法和培养法(均P<0.05)，但是，传统方法(墨汁染色法和培养法)特异度和阳性预测值高于隐球菌荚膜多糖抗原检测(胶体金法和乳胶凝集法)方法(均P<0.05)，见表2。

表2 4种检测方法的灵敏度和特异性比较(%)

表3 4种方法对隐球菌性脑膜炎的检测结果比较

2.4不同检测方法对隐球菌性脑膜炎的检测结果比较 墨汁染色法与其他3种检测方法比较，检测结果差异均有统计学意义(均P<0.05)，培养法与胶体金法和乳胶凝集法比较，检测结果差异无统计学意义(均P>0.05)，见表3。

3 讨 论

新型隐球菌广泛存在于土壤与鸽粪中，在组织中呈圆形或卵圆形，革兰染色阳性，菌体被宽厚的荚膜所包裹，适宜的培养温度为37 ℃，菌落呈乳白色，日久呈黏液状，根据其荚膜抗原性的不同可分为A、AD、D、B和C 5个血清型[4]。新型隐球菌是一种机会性致病真菌。隐球菌性脑膜炎是最常见的肺外感染，其高病死率引起全球的特别关注。据报道，2014年在低收入国家隐球菌性脑膜炎患者病死率高达70%，中等收入国家其病死率高达40%，欧美国家其病死率约20%～30%[5]。传统的隐球菌性脑膜炎的检测主要是以墨汁染色直接镜检法和培养法为主，这是基础和经典的方法。目前，临床常用的方法还有以隐球菌荚膜多糖抗原为检测靶标的血清学诊断技术，比如：新型隐球菌荚膜抗原乳胶凝集法、胶体金法等以及其他如影像学、分子技术和病理组织学检查等诊断方法。

本研究中利用墨汁染色法、培养法、胶体金法和乳胶凝集法对31例临床诊断隐球菌性脑膜炎患者和40例非隐球菌性脑膜炎患者脑脊液标本进行检测，结果显示隐球菌荚膜多糖抗原检测方法(胶体金法和乳胶凝集法)灵敏度和阴性预测值显著高于传统的检测方法，尤以乳胶凝集法的灵敏度最高(96.8%)。但是传统方法的特异度和阳性预测值高于胶体金法和乳胶凝集法。传统的墨汁染色法是最简便快速的诊断方法，但阳性率最低(48.3%)，低于文献[6]报道的阳性率75.0%，主要因为该方法依赖标本的采集时机、采集量和检验人员的技能水平，感染早期病原菌数量少、采样存在干扰因素或者检验人员经验不足均易导致误诊和漏诊。培养法是隐球菌性脑膜炎诊断的金标准，但耗时且敏感性低，不能满足对感染的早期诊断。本研究中培养法敏感性约为80.6%，有6例未培养出，可能是由于接种量过少或者患者处于感染早期，使得脑脊液中病原菌数量过少所致。

近年来，以乳胶凝集法和胶体金法为代表的隐球菌荚膜多糖抗原的检测方法越来越多的应用于临床。胶体金法利用免疫层析技术，以胶体金标记单克隆抗体，可检测新型隐球菌的全部血清型[7]。该方法不需要昂贵的仪器设备，且简便易操作，检测时间短，更适于床旁检测。而且其灵敏度和特异度较传统方法高，更适合用于隐球菌性脑膜炎的快速筛查。本研究中胶体金法的灵敏度与特异度分别为87.1%和95.0%，略低于文献报道的91.7%和99.6%[7]。其中有4例标本出现了假阴性结果，可能是由于患者在感染早期，抗原滴度较低，且该方法结果判定依赖主观判断所致。乳胶凝集法是4种方法中灵敏度和特异度最高的检测方法，分别高达96.8%和97.5%，与文献[8]报道一致。在系统性红斑狼疮患者或者患者存在风湿因子的情况下可出现假阳性结果，而在感染早期或者抗原滴度高等情况下,乳胶凝集法会出现假阴性结果[6,9-10]。

总之，传统方法对隐球菌性脑膜炎检测更直观且更可靠，是临床实验室最基本的检测方法，尤以传统培养法为辅助诊断隐球菌性脑膜炎的金标准。隐球菌荚膜多糖抗原检测方法(胶体金法和乳胶凝集法)与传统方法相比具有较高的灵敏度，可作为隐球菌性脑膜炎的早期诊断方法。其中胶体金法具有操作简单，报告迅速且可靠的特点，可用于临床的快速筛查，对隐球菌性脑膜炎的辅助诊断具有十分重要的意义。