实验用小型猪封闭群中OB基因多态性的研究分析

陈志雄，胡志刚，王洪洋，张莺莺，曹建国，吴华莉，谈永松，涂尾龙*

(1 原南京军区司令部农副业基地，江苏 南京 210016；2 原上海警备区南汇农副业基地，上海 200035；3 上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；4 上海种猪工程技术研究中心，上海 201106)

实验用小型猪是我国宝贵的物种资源，也是现代生物医学中应用最广的实验动物之一。由于小型猪体型小，操作方便，同时小型猪的血液生理生化指标和人的比较接近，皮肤等器官和人的比较相似，就目前来说小型猪应该是人类疾病动物模型的最佳实验动物。作为实验猪，小型猪的体型对实验操作者来说尤为重要。在对小型猪进行育种的时候，所采用的方法与商品猪的不一样，并不是挑选体型大的留种。因此，研究小型猪肥胖基因对于小型猪育种非常重要。

肥胖(Obese，OB)基因在调控实验猪繁殖和采食等代谢方面发挥着极其重要的功能，其表达的产物是调控动物机体能量平衡和脂肪细胞分泌的重要作用。猪OB基因由3个外显子和2个内含子组成，定位于18号染色体上，5’端是97 bp的先导序列，3’端是3.7 kb的非编码序列。目前，OB基因一直是国内外学者的重要研究方向，有研究表明该基因的多态性和猪的多个性状相关，如肉质性状和繁殖性状等。由于我国对实验用小型猪的研究起步较晚，因此有关实验用小型猪OB基因的研究鲜见报道。本研究采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)方法检测实验用小型猪OB基因的多态性，为实验用小型猪育种提供分子标记辅助育种，积累实验用小型猪的基础资料，更好地对实验用小型猪选种选育。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

本次试验的常用试剂：2×Taq Master Mix(Dye Plus)购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：P112；Pvu Ⅱ和Hinf Ⅰ购自New England Biolabs公司，货号分别为：R0151S和R0155T；DL2000 DNA Maker购自上海翊圣生物科技有限公司，货号：10501ES60；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP304。

1.2 试验动物

试验动物选自上海市农业科学院实验用小型猪封闭群核心群中30头实验用小型猪，年龄在2～3月。

1.3 试验方法

1.3.1 猪耳朵组织基因组提取

试验时称取0.3 mg猪耳朵组织，将其放入组织破碎机中破碎，将破碎的组织样品放入1.5 mL的EP管中，使用天根公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取组织DNA，并将30个样品分别标记。

1.3.2 OB基因3 469位点检测(PCR-RFLP)

设计针对OB位点的引物，并委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。

OB-F：5’-GAG CCA ACA TCT CTC TCG CTG AG -3’

OB-R：5’-GAC TCC TGG AAG CTC AGG TTT CTT C-3

1.3.3 PCR反应体系

按照表1配置PCR反应体系。

94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。

1.3.4 酶切反应体系

酶切反应体系如表2所示。酶切温度37 ℃，时间30 min。

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测

配置3%琼脂糖凝胶，电压120 V，时间12 min，结果如图1、图2和图3所示。

2.2 统计基因型

从酶切结果条带分析，实验用小型猪OB基因的基因型如表3所示。

3 讨论与分析

严燕等对圩猪OB基因单核苷酸多态性检测发现，OB基因存在C/T、A/G、C/T和G/T这4个多态位点，群体存在A和B等位基因，表现3种基因型：AAABBB。Jiang等研究发现，4个多态位点分别位于867 bp、1 112 bp、3 469 bp和3 714 bp处。OB基因目前在动物体内有着非常广泛的生理功能，不仅会影响动物的许多疾病，还与非常多的经济性状相关联。Stephens对猪染色体研究发现，OB基因定位于18号染色体上，与已有研究的神经肽Y(NeuroPeptide Y，NPY)基因表达产物NPY一样，都能增强促黄体素(Luteinizing Hormone，LH)的释放，对猪的繁殖性能有很大的影响。但是，在小型猪方面，和肥胖相关的OB基因鲜见报道。本研究重点对实验用小型猪的OB基因多态性进行了检测，在30个个体中，5个个体为AA基因型，19个个体为AB基因型，6个个体为BB基因型。检测主要是为了填补实验用小型猪基础资料，并为小型猪选育选种提供分子标记辅助育种。由于实验用小型猪封闭群数量有限，需要等封闭群数量扩大，下一步对群体进行OB基因检测，对基因型频率进行检测，更进一步的掌握实验用小型猪的OB基因型，为小型猪选育更适合实验动物提供有力支撑。