毛蕊异黄酮对人乳腺癌细胞增殖及凋亡的作用及机制研究*

曾文郸 苗慧 任倩瑶△

(1. 桂林医学院基础医学院实验教学中心；2. 桂林医学院广西肿瘤免疫与微环境肿瘤实验室，广西 桂林 541004)

乳腺癌作为严重威胁世界女性健康的杀手之一，占女性所患恶性肿瘤的13.7%，且发病率逐年攀升[1]。虽然现代医学对乳腺癌的诊治工作取得了显著进展，但耐药现象明显，易导致乳腺癌复发、转移[2]。因此，寻求安全有效的新型药物，改善乳腺癌微环境，提高治疗效果，是当今乳腺癌研究的热点，因此是从植物、水果和蔬菜中提取出来的非甾体类化合物，分为黄豆素类、木酚素类和异黄酮类三种，其化学结构与内源性雌激素极为相似[3]，因此具有雌激素样作用，可用于治疗激素类疾病，如心血管疾病、卵巢癌、乳腺癌[4]等。研究表明，毛蕊异黄酮作为一种从中药黄芪中分离出来的异黄酮类植物雌激素，具有多种潜在的药理活性。本课题组一直致力于毛蕊异黄酮对肿瘤细胞的研究工作，发现毛蕊异黄酮能够抑制ER(-)乳腺癌、结直肠癌细胞的增殖并诱导凋亡[5]，但是对ER(+)乳腺癌细胞的研究甚少。本研究拟探讨毛蕊异黄酮对ER(+)乳腺癌细胞增殖能力的影响及其可能的信号通路调控机制，为临床乳腺癌的治疗提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞株MCF-7、T47D购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；毛蕊异黄酮(纯度>98%)购自成都普瑞法有限公司，浓度梯度分别为0、25、50、100 μM溶于DMSO，4℃保存；DMEM培养基、10%FBS胎牛血清、青链霉素、胰酶购自Gibco公司；CCK8试剂购自Sigma公司；Hoechst 33258凋亡染色试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；Annexin V/FITC流式细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；4%多聚甲醛溶液、30%丙烯酰胺、Glycine、APS、SDS购自北京索莱宝科技有限公司；ERK1/2、p-ERK1/2一抗购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

ER阳性人乳腺癌细胞株MCF-7、T47D均为本实验室保存，均用含有10%FBS胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基进行细胞培养，培养条件为37℃，CO2含量为5%。

1.2.2CCK8生长曲线

分别取对数生长期细胞，经胰蛋白酶消化后接种于96孔板中，接种体积为100 μL·孔-1，接种密度为3×105·孔-1。细胞贴壁之后，更换含有不同浓度毛蕊异黄酮(0、25、50、100 μM)的培养基，每种浓度设5个复孔，继续培养不同时间后(0、24、48、72 h)，每孔加入CCK8试剂10 μL溶液，静置4 h，温度37 ℃，孵育1 h后，在450 nm波长下用酶标仪检测吸光度。细胞抑制率(%)=(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。实验重复3次。

1.2.3Hoechst 33258荧光染色法

分别取对数生长期细胞，经胰蛋白酶消化后接种于6孔板中，接种体积为2 mL·孔-1，接种密度为5×105·孔-1。细胞贴壁之后，更换含有不同浓度毛蕊异黄酮(0、50、100 μM)的培养基，每种浓度设3个复孔，继续培养48 h后，吸尽孔内培养基，加入4%多聚甲醛固定液0.5 mL，10 min后去固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，避光染色5 min后，吸除Hoechst 33258染色液，用PBS洗2次，每次3 min。在倒置荧光显微镜下观察细胞核形态，记录细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.2.4流式细胞术

分别取对数生长期细胞，经胰蛋白酶消化后接种于6孔板中，接种体积为2 mL·孔-1，接种密度为5×105·孔-1。细胞贴壁之后，更换含有不同浓度毛蕊异黄酮(0、50、100 μM)的培养基，每种浓度设3个复孔，继续培养48 h后，PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×106·mL-1，制成单细胞悬液，加入100 μL Binding Buffer和10μL FITC标记的Annexin-V，室温避光30 min，再加入5 μL PI，避光5 min后，加入400 μL Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测。实验重复3次。

1.2.5Western blotting法

分别取对数生长期细胞，经胰蛋白酶消化后接种于6孔板中，接种体积为2 mL·孔-1，接种密度为5×105·孔-1。细胞贴壁之后，更换含有不同浓度毛蕊异黄酮(0、50、100 μM)的培养基，每种浓度设3个复孔，继续培养48h后，用蛋白提取试剂盒按操作说明提取细胞总蛋白，紫外线分光光度计测定蛋白浓度后煮沸变性，SDS-PAGE凝胶电泳，电转4h至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别孵育ERK1/2、p-ERK1/2一抗单克隆抗体(1：1000)，4 ℃过夜，TBST洗膜三次，加入二抗(1：5000)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL plus发光剂，显色，暗室曝光，计算机定量分析。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 毛蕊异黄酮对MCF-7、T47D细胞增殖的影响

25、50、100 μM毛蕊异黄酮处理MCF-7、T47D细胞，CCK8实验结果显示，细胞增殖过程均受到毛蕊异黄酮的抑制，并呈剂量和时间依赖性(P<0.05)。同时，经100 μM毛蕊异黄酮浓度处理72 h后，MCF-7、T47D细胞增殖的抑制效果最为明显(P<0.05)，见图1。

图1 CCK8检测不同浓度毛蕊异黄酮对MCF-7、T47D细胞增殖的影响

2.2 毛蕊异黄酮对MCF-7、T47D细胞凋亡的影响

50、100 μM毛蕊异黄酮作用MCF-7、T47D细胞48 h后，Hoechst 33258荧光染色显示，随着毛蕊异黄酮药物浓度升高，细胞内出现核固缩，并且核碎裂与凋亡小体明显增加，呈剂量依赖性(P<0.05)，见图2。流式细胞术检测结果表明，MCF-7、T47D细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率随药物浓度升高而增高，100 μM毛蕊异黄酮对细胞促凋亡效应更为显著(P<0.05)，见图3。

图2 Hoechst染色测定不同浓度毛蕊异黄酮对MCF-7、T47D细胞凋亡的影响(×400)

图3 流式细胞术检测不同浓度毛蕊异黄酮对MCF-7、T47D细胞凋亡的影响

2.3 毛蕊异黄酮对ERK1/2蛋白磷酸化水平的影响

50、100 μM毛蕊异黄酮作用乳腺癌MCF-7细胞48h后，Western blotting结果显示，与对照组相比，50、100 μM毛蕊异黄酮药物组中的p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达比值明显降低，并且这种抑制水平随着毛蕊异黄酮浓度的升高而增加，表明其具有剂量依赖性(P<0.05)，见图4。

图4 Western blottin检测不同浓度毛蕊异黄酮对ERK1/2蛋白磷酸化表达水平的影响注：A-MCF-7乳腺癌细胞中p-ERK1/2蛋白相对表达量；B-蛋白质灰度值扫描统计；p-ERK1/2与ERK1/2蛋白表达相比，* P<0.05。

3 讨论

植物雌激素与哺乳动物体内雌激素，无论在化学结构和生物活性方面都十分相似，能够发挥类雌激素和抗雌激素双向调节作用[6]。据研究表明，多种植物雌激素可以通过调节肿瘤侵袭转移相关因子的表达，抑制癌细胞的迁移侵袭能力[7,8]。毛蕊异黄酮是一种典型的植物雌激素，可以通过结合雌激素受体调控相关信号通路的表达，发挥抗肿瘤、抗炎等多种功效[9]。值得注意的是，我们之前的研究已经证明植物雌激素毛蕊异黄酮成功地抑制了ER(-)乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。但毛蕊异黄酮是否对ER(+)乳腺癌细胞具有相同的诱导作用，其涉及的具体机制如何，这些都有待进一步地研究。

基于此原因，本研究中毛蕊异黄酮明显抑制ER阳性人乳腺癌MCF-7、T47D细胞增殖，且呈时间和剂量依赖性，具体表现为随着药物浓度和作用时间的增加，细胞的增殖抑制率增高。同时，经毛蕊异黄酮处理后的乳腺癌MCF-7、T47D细胞，从形态学和分子生物学层面均出现凋亡细胞数目增多，凋亡率增加，呈现剂量依赖性。特别是在药物浓度为100 μM毛蕊异黄酮时，细胞增殖抑制率和凋亡率效果显著。

细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)是MAPK家族中的主要成员，是细胞信号传导的重要途径，其激活级联反应已被广泛研究。ERK1/2磷酸化后即p-ERK1/2，能够将多种细胞外信号通过磷酸化活化逐级传递至细胞核，作用于细胞内的生长因子、细胞因子、肿瘤启动因子，例如Elk-1、c-myc、c-fos、c-jun、NF-κB等转录因子和其他蛋白激酶底物[10]。ERK1/2的激活能够参与调控有丝分裂、减数分裂等功能，与细胞生长、增殖、分化、迁移和存活密切相关[11]。在乳腺癌与MAPK信号通路关系的研究中发现，p-ERK1/2蛋白高表达存在于乳腺癌中；而当MAPK通路被抑制时，p-ERK1/2蛋白表达则下降[12]。我们的研究结果与之前的研究结果相吻合，当不同浓度毛蕊异黄酮处理乳腺癌MCF-7、T47D细胞后，p-ERK1/2 / ERK1/2比值下降，并呈剂量依赖性，提示毛蕊异黄酮可以降低ERK1/2磷酸化蛋白水平，从而抑制MAPK通路的活性。

综上所述，毛蕊异黄酮能够抑制乳腺癌MCF-7、T47D细胞的增殖和诱导其凋亡的作用，其机制可能是通过抑制MAPK通路的激活而实现的。毛蕊异黄酮在乳腺癌的治疗中存在广泛的应用前景，本研究为毛蕊异黄酮作为抗乳腺癌药物提供了一定的实验依据。