黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁营口分离物基因组测定及分段基因克隆

李立梅 毛 赫 左彤彤

摘要 黄瓜绿斑驳花叶病毒 Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV）是葫芦科作物的重要检疫性病毒。本研究以田间自然感病的西瓜叶片为试材，采用RTPCR获得该病毒（CGMMVLNYK）基因组全长（登录号MG745849），以pBluescript Ⅱ SK（）为载体，分别克隆其所编码的4段基因，并采用人工接种验证它们的体外侵染活性。结果表明：该病毒与韩国分离物KW（登录号AF417242）亲缘关系最近，相似度达99.8%，并成功克隆了CGMMVLNYK编码的4段基因，分别记为RNA1～RNA4。经人工接种，发现RNA1和RNA4能侵染葫芦，表现明显花叶症状，与该病毒接种葫芦症状一致，且接种RNA1后的症状较RNA4明显，4种RNA混合接种症状最为明显，经RTPCR检测，发病植株可扩增到与接种的RNA大小相等的片段。

关键词 黄瓜绿斑驳花叶病毒; 基因组全长; 克隆

中图分类号： S 436.421

文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018222

Abstract Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） is an important quarantine virus of cucurbits. In this study， the complete nucleotide sequence of the virus （GenBank accession no. MG745849） was obtained by RTPCR in the naturally infected watermelon leaves. The four gene fragments encoded by the CGMMV were cloned into pBluescript Ⅱ SK（） containing T7 promoter， respectively， and the invasive activity in vitro was verified by artificial inoculation. The results showed that the CGMMV was most closely related to the KW （GenBank accession no. AF417242） isolated from Korea， with an identity of 99.8%. The 4 infectious gene fragments of the CGMMV were successfully constructed and the segments RNA1 and RNA4 could infect cucurbits and cause obvious systemic mosaic in leaves. Moreover， the symptoms caused by the segment RNA1 were more severe than those by RNA4 after artificial inoculation. The symptoms were most obvious when the four segments of RNA inoculated at the same time. The RNA fragment amplified in diseased plants was equal in length to the inoculated viral RNA by RTPCR.

Key words Cucumber green mottle mosaic virus; full length of genome; clone

黃瓜绿斑驳花叶病毒Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）是葫芦科作物的重要病毒，西瓜感染该病毒后植株生长缓慢，果实内部严重变色或腐烂，果肉纤维化、水渍状，严重时丧失食用价值，俗称西瓜倒瓤病或血瓤病[1]。CGMMV给葫芦科作物生产带来严重影响，1998年在韩国大面积暴发，造成463 hm2绝收[2];2004年在巴基斯坦部分地区葫芦科作物发病率达46.9%[3];2005年中国辽宁省盖州市由于种子带毒而导致西瓜大面积感染CGMMV，发生面积333 hm2，其中13 hm2绝收[4]，引起农业部、质检总局等相关部门的高度重视。根据我国农业部公布的《全国农业植物检疫性有害生物分布行政区名录（2014）》，辽宁、上海、江苏、浙江、安徽、山东、湖北、湖南、广东、广西、海南等11个省市区74个县市区均有CGMMV分布。迄今对于该病毒的致病机理研究多集中在生理生化水平，Adzhemyan等研究认为黄瓜感染该病毒后可导致植株体内可溶性糖和游离氨基酸含量的积累[5];Srivastava等研究表明该病毒可通过影响磷酸戊糖途径，导致多酚氧化酶活性发生改变，进而导致酚类物质积累[6]。本研究首先测定了CGMMV国内首发区的基因组全长序列，然后依据全基因组序列分别克隆了该病毒编码的4段基因，旨在找到可侵染寄主植物的基因，为今后该病科学有效的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试毒原及载体

自然感病的西瓜植株采自辽宁省营口市，田间表现症状为叶片斑驳、花叶、叶脉绿带状、浓绿凹凸斑，经RTPCR检测，定名为CGMMVLNYK，采用汁液摩擦法繁殖保存在防虫温室的葫芦上;侵染性克隆载体为pBluescript Ⅱ SK（）载体。

1.1.2 试剂

TRIzol试剂购自Invitrogen;LA Taq Polymerase、pMD18T simple vector、感受态细胞DH5α、限制性内切酶Not Ⅰ和Xho Ⅰ、TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit （Code No.D6110A）、TaKaRa High Fidelity PrimeScriptTM RTPCR Kit （Code No. DR027A）、TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Polymerase （Code No. DR010S）、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 （Code No. DV805A）、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0、TaKaRa in vitro Transcription T7 Kit （Code No. D6140）、TaKaRa DNA Ligation Kit（Code No.D6023）等购自宝生物工程（大连）有限公司;Ribo m7G Cap Analog （Promega Code： P171B）购自Promega生物技术有限公司。

1.1.3 引物的设计与合成

1.2 方法

1.2.1 RTPCR扩增

参照Invitrogen公司的TRIzol法提取植物总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性后，以提取的植物总RNA为模板，使用TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit 合成cDNA，采用LA Taq Polymerase进行扩增，预计扩增片段分别为1.1、2.4、2.5、0.7 kb，PCR产物经DNA回收试剂盒纯化后克隆于pMD 18T载体，转化 E.coli DH 5α感受态细胞后经蓝白斑筛选阳性克隆，送宝生物工程（大连）有限公司进行双向测序，以确定正确的碱基序列。

1.2.2 病毒的提纯和电镜观察

病毒提纯程序参考裘维蕃[8]的方法，病毒提纯后采用负染法观察，将铜网在样品液滴上悬浮3～5 min，吸去多余的液体，再经2%磷钨酸（pH7.0）进行负染色3～5 min，自然干燥后在透射电镜下观察药剂处理不同时间下病毒粒子的形态。

1.2.3 基因克隆

依据所获得的全基因组序列设计引物，以CGMMV营口分离物的总RNA为模板，利用TaKaRa High Fidelity PrimeScriptTM RTPCR Kit进行反转录，引物使用TaKaRa 5′Full RACE Kit （D315）中的Random 9 mers;获得cDNA后，采用巢氏PCR分别克隆CGMMV编码的4个开放阅读框，第一步PCR使用TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Polymerase进行扩增，引物为ORF1/ORF2/ORF2/ORF4/F1和ORF1/ORF2/ORF2/ORF4/R1，获得的PCR产物进行第二步PCR扩增，引物为ORF1/ORF2/ORF3/ORF4/F2，ORF1/ORF2/ORF2/ORF4/R2，PCR产物使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0切胶回收;回收产物引入酶切位点NotⅠ 和XhoⅠ，将所得的4个片段分别连入pBluescript Ⅱ SK（）载体，经NotⅠ和XhoⅠ酶切后，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0载体回收，使用TaKaRa DNA Ligation Kit中的連接酶，将回收后的目的片段与pBluescript Ⅱ SK/Not I/ Xho I，16℃，过夜连接;感受态细胞DH5α制备好后，将产物转化至大肠杆菌，然后使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0提取质粒，每个片段分别选择两个阳性克隆质粒，命名为ORF11、ORF12，ORF21、ORF22，ORF31、ORF32，ORF41、ORF42。先分别使用引物BcaBEST Primer M1320（TaKaRa Code No.D3881）和M13 Reverse （TaKaRa Code No.D3830）对所选质粒进行测序，之后使用引物ORF1F528、ORF1R1614、ORF1F1447、ORF1F2022、ORF1F2588将ORF11、ORF12测通，使用引物CTD041F446对ORF21、ORF22测通。

1.2.4 体外转录

使用SacⅠ进行单酶切，将目的质粒线性化，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收酶切产物，酶切产物进行体外转录，反应体系如下：SacⅠ酶切产物 3 μL，10×Transcription Buffer 2 μL，ATP Solution （50 mmol/L） 2 μL，UTP Solution （50 mmol/L） 2 μL，CTP Solution （50 mmol/L） 2 μL，GTP Solution （稀释至10 mmol/L） 2 μL，Ribo m7G Cap Analog （40 mmol/L） 2 μL，RNase抑制剂（40 U/μL） 0.5 μL，T7 RNA聚合酶（50 U/μL） 2 μL，RNase Free dH2O定容至20 μL，上述体系中加入4 μL （即20U） DNaseⅠ，37℃反应1 h，然后进行纯化（去除残留的DNA），纯化的操作流程为：加入30 μL 3 mol/L CH3COONa （pH5.2），加DEPC水至300 μL，混匀;加入300 μL PCI（苯酚、氯仿、异戊醇，比例为25∶24∶1），室温静置15 min，12 000 g，离心5 min;加入300 μL CI（氯仿，异戊醇，比例为24∶1），室温静置10 min，12 000 g，离心5 min，加入3 μL NA Carrier，混匀，加入300 μL异丙醇，冰浴10 min，12 000 g，离心5 min，加入1 mL 70%预冷乙醇，洗涤，12 000 g，离心1 min，室温干燥后溶于16.5 μL RNase Free dH2O中，分别标记为RNA1、RNA2、RNA3、RNA4。

1.2.5 体外侵染

将获得体外转录物RNA1、RNA2、RNA3、RNA4排列组合，进行体外侵染，以期确定是哪段基因，或者哪几段基因共同完成该病毒的侵染。接种方法：体外转录物与等体积的2×GKP pH9.2缓冲液（50 mmol/L 甘氨酸，30 mmol/L K2HPO4，1%膨润土，1%硅藻土）混合为接种液，取生长良好，一叶一心的葫芦Lagenaria siceraria（Molina） Standl（品种：‘不死鸟），将灭菌的石英砂均匀撒于待接种叶片上，每叶用10～20 μL接种液（内含0.2 μg病毒），轻轻涂抹叶片，5 min后用无菌水冲洗。接种后的植株生长于防虫的生长箱中，温度为25℃，保持12 h光照，观察症状，于接种21 d后取样，进行RTPCR检测，以接种CGMMV为阳性对照，以接种2×GKP pH9.2缓冲液为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 CGMMV全基因序列的测定

2.1.1 RNA的提取与检测

取采自辽宁省营口盖州地区的西瓜叶片样品5份，提取总RNA，取1 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果如圖1：图中所示3条带，分别为28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA，所提的RNA完整性很好，没有发生降解，可以用于下一步的试验。

2.1.2 RTPCR检测及全基因组序列测定

以植物总RNA为模板，利用4 对引物通过RTPCR 扩增得到4 条特异DNA片段，大小约为1.1、2.4、2.5和0.7 kb，与预期扩增结果相符，且扩增得到4个特异片段相互重叠，覆盖了CGMMV的完整基因组。产物克隆后经蓝白斑筛选，进行双向测序。经比对，该分离物与韩国分离物（登录号AF417242）亲缘关系最近，相似度达99.8%，与日本的SH株系、韩国的甜瓜分离物及印度Delhi地区的分离物的亲缘关系亦较近，但与俄罗斯CGMMVMC及西班牙CGMMCSP分离物亲缘关系稍远，同源性仅为90%。

2.2 CGMMVLNYK分段基因克隆

2.2.1 CGMMV的提取及病毒总RNA的提取

经磷钨酸负染色后在电镜下观察发现，病毒粒子直棒状，长约300 nm，宽约18 nm （图2）。取病毒的RNA 1 μL，进行3%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3，检测结果表明，所提的RNA完整性很好，没有发生降解，可用于下一步的克隆试验。

2.2.2 RTPCR扩增结果

第一步RTPCR扩增后，取5 μL PCR产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图4，将第一步PCR产物采用相同的反应体系和反应条件，进行第二步PCR扩增，取5 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图5，分别得到了大小约为3.5、1.5、0.8、0.5 kb的片段，与预期的大小相符，纯化后克隆，上述各PCR产物经Not Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切后，切胶回收得到相应大小的目的片段。

2.2.3 重组载体的构建

通过PCR扩增分别得到片段D1（3.5 kb）、D2（1.5 kb）、D3（0.8 kb）、D4（0.5 kb），与预期的大小相符，片段D1、D2、D3、D4 PCR产物回收酶切后分别连接至pBluescript Ⅱ SK （）载体，筛选出质粒重组子，并测序以验证插入序列的正确性，使用DANMAN软件进行比对，克隆得到的序列与原分离物一致，并未发现突变，可以用于下一步的体外转录。

2.3 体外转录

2.3.1 酶切产物回收

克隆得到的目的片段用SacⅠ酶切后，用电泳检测确已切开。分别命名为pCGMMV1、pCGMMV2、pCGMMV3、pCGMMV4（图6a～d）。

2.3.2 体外转录产物电泳检测

以线性化的pCGMMV为模板，采用加帽的方法进行体外转录，电泳发现，条带不唯一，这其中有可能还存在线性化的模板，也有可能是RNA体外转录时出现了二级结构，但均得到了目的大小的条带，可以用于体外侵染。分别命名为RNA1、RNA2、RNA3、RNA4。（图7a～d），同时使用Nanodrop超微量可见紫外分光光度计进行浓度检测，浓度分别为1 105、1 380、1 320、1 190 ng/μL。

2.4 体外侵染

2.4.1 症状观察

分别接种经体外转录获得的4种RNA及4种RNA的排列组合到葫芦苗上，接种15 d后，发现接种RNA1、RNA4及含有RNA1、RNA4组合的葫芦苗出现了不同程度的花叶症状，接种含有RNA1的处理比含有RNA4的症状明显，其中含有4种RNA处理的症状最明显，叶片出现坏死斑点（图8a～i）。

2.4.2 RTPCR检测

对所有接种植株取样后进行RTPCR检测，发病植株中可检测到与RNA1和RNA4大小相等的片段，而未发病植株未扩增到目的片段。

3 结论与讨论

CGMMV是重要的种传病毒，在我国多个葫芦科作物种植区造成了不同程度的危害。辽宁省营口市盖州是我国CGMMV发生最早的地区，导致的经济损失巨大。核苷酸序列提供了病毒之间亲缘关系的重要信息。此前，国内对CGMMV亲缘关系的研究大多是基于其外壳蛋白的核酸序列，李红霞等[9]报道的CGMMV的外壳蛋白序列分析显示，国内不同地区、不同寄主的CGMMV分离物的外壳蛋白基因序列差异较小，同源率为97.5%～99.8%。本研究通过对辽宁省主要西瓜产区CGMMV西瓜分离物基因组的同源性分析显示，辽宁省营口市盖州的CGMMV分离物与日本、韩国报道的CGMMV分离物亲缘关系较近，尤其是韩国西瓜分离物，充分说明辽宁省内发生的CGMMV与日本、韩国等报道的CGMMV可能有共同的流行学意义上的侵染源，进一步佐证了我国的CGMMV由日本、韩国引种传入的推断。

植物RNA病毒侵染性克隆由Ahlquist等[10]在雀麦花叶病毒Brome mosaic virus （BMV）首次报道，至今国外已有烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus （TMV）、马铃薯X病毒Potato virus X （PVX）、烟草脆裂病毒Tobacco rattle virus （TRV）等大量的植物病毒被成功地构建了全长 cDNA侵染性克隆[1114]。RNA病毒的cDNA侵染性克隆技术的发展，使人们可以在DNA水平上开展 RNA 病毒的分子生物学研究，将植物病毒侵染性克隆改造成病毒载体，可以用于外源基因在植物上的大量表达，为深入研究RNA病毒与寄主的相互作用机制提供了有效手段[15]。本研究以CGMMVLNYK为模板，分别将该病毒所编码的4段基因克隆至pBluescript Ⅱ SK（）载体，并在体外完成转录，验证各段基因的侵染活性，通过体外侵染，自然条件下，通过伤口RNA2和RNA3不能成功侵染葫芦，RNA1和RNA4可侵染葫芦，发病症状和CGMMV自然条件下侵染葫芦一致，从人工接种发病的葫芦中检测的基因序列和原病毒序列相似性为100%，符合柯赫氏法则 （Kochs Rule），而关于该病毒的报道，大部分报道猜想RNA1参与该病毒的复制，RNA4为该病毒的外壳蛋白。本研究成功获得可体外侵染的RNA1和RNA4，初步证实这两段基因直接导致寄主植物表现典型的花叶症状，但哪段基因与西瓜倒瓤直接相关，仍需进一步研究。

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（责任编辑：田 喆）