血液乙醇含量测试影响因素筛选及模型建立

涂国章 张显强

（1 贵州警察学院刑事技术系 贵州 贵阳 550005；

2 贵州省道路交通事故鉴定工程技术研究中心 贵州 贵阳 550005）

1 引言

随着社会经济的发展，人民生活质量的普遍提高，机动车尤其是家用汽车已经走进千家万户。与此同时，随着机动车保有量的增加，由机动车引发的交通事故也不断增多。国家统计局资料显示；2017年底，我国机动车保有量为3.1亿辆，其中汽车2.17亿辆，相比2016年增加11.85%。2016全年共发生道路交通事故数21.2846万起，机动车交通事故数19.2585万起，由酒驾引发的0.48万起，约占2.5%，相比2011前的10%降低约7.5个百分点。另据公安部交管局统计，酒驾是引起交通事故的主要因素之一。酒精的刺激作用使人兴奋，但酒精在人体血液内达到一定浓度时，人对外界的反应能力及控制能力就会下降，处理紧急情况的能力也随之降低。当驾驶者血液中酒精含量达80mg/100mL时，发生交通事故的几率是血液中不含酒精时的2.5倍；达到100mg/100mL时，发生交通事故的几率是血液中不含酒精时的4.7倍[1-2]。虽然2011年5月醉驾入刑实施后，酒后驾驶交通事故数呈下降趋势，但总体数值居高不下，国内酒后驾驶现象仍然较为严重。

目前法律法规对酒驾有严格的限制，但对酒驾的认定主要以血液乙醇含量高低为依据。依法治国背景下，对血液乙醇含量检测条件的把握、检测结果的准确性、受检人员饮酒程度进行公正的认定显得尤为重要。然而对于血液乙醇含量准确测试的影响因素较多，如血储容器、保存温度、保存时间等，在以往研究中，马栋等对血液中乙醇保存稳定性进行了探讨，发现温度、血储容器中空气所占比例、质量浓度、防腐剂4个因素中温度对血液乙醇稳定性影响最大[3]。以往的研究有探讨抗凝剂的有无对血液乙醇检测结果的影响[4]，不同抗凝剂对血液乙醇检测结果的影响等[5-6]，但未明确最佳血储容器，其结果不能有效指导实践。酒驾血样保存温度控制在什么范围至今尚无定论，目前国内这方面研究大多探讨设定冰箱4～8℃、室温25℃储存条件时的影响，对于4℃以下和30℃以上储存条件的探讨很少涉及[7-8]，而实践中保存血样温度随意性大，有在常温保存的、有在4～8℃冰箱保存的、有在-20℃冰柜保存的，最适保存温度尚待确立。在保存时间方面，血样采集后究竟保存多长时间对测试结果没影响，国内对这方面的探讨很少，有提到在4h内尽快测定的，有笼统地说及时测定的[8-9]。虽然上述文献对血储容器、保存温度、保存时间等影响血液乙醇含量的研究都有涉及，但均并未明确最佳条件。由于行业标准中没有相关规定，缺乏统一规范，实践中对于血储容器、保存温度、保存时间的使用和选择上混用现象较普遍，随意性大，这势必会导致检测结果失准，影响交管部门对酒后驾驶的判定。因此，研究血液乙醇含量稳定性与血储容器、保存温度、保存时间的关系，探讨最佳血储容器、最佳保存温度和有效保存时间极具必要性，对于协助执法人更为科学地采集血样、合理保存血样、把握有效的分析检验时间，取得可靠的检测结果具有重要的价值意义。

2 材料与方法

2.1 样本来源

选取健康成年男性30名，饮酒后30min后至检测中心抽取静脉鲜血2mL各10管，血样分别储存于EDTA-k2管、肝素钠管、枸橼酸钠1:9管（柠檬酸钠1:9）、氟化钠-草酸钾管、枸橼酸钠1:4管（柠檬酸钠1:4）中，立即检测各管的血液乙醇含量，选择其中乙醇浓度≥20mg/100mL且数值接近的血样为研究样本，每种采血管选择10支，共50支并在冰箱（4～8℃）下冷藏保存，5种管依次以A、B、C、D、E标记，每种管的10支管分别以1-10编号进行初筛。在此基础上，选择血液乙醇含量检测结果稳定性较好的真空抗凝管，各取10支乙醇浓度≥20mg/100mL且数值接近的血样在-20℃下冰柜保存进行第二次筛选。选择血液乙醇检测结果稳定性最好的管50支，采取乙醇浓度≥ 20mg/100mL且数值接近的血样，其中40支管分4组，每组10支分别在-20℃、4～8℃、25℃、35～42℃这4个温度下储存（分别依次标记为Z、Y、X、W，各种抗凝管的10支管依然分别按1～10号编号），剩余的10支管在-20℃下温度储存180 d检测保存时效性。

2.2 仪器分析条件

色谱仪型号：岛津GC-2010plus。顶空仪型号：岛津HS-20。色谱柱1：Rtx-BAC1，30×0.32毛细柱。色谱柱2：Rtx-BAC2，30×0.32毛细柱。柱温：40℃。进样口温度：150℃，柱流量5mL/min，吹扫流量3mL/min，分流比6.4。检测器FID1和FID2：温度250℃。顶空进样：恒温炉65℃，样品流路温度105℃，传输线温度110℃，样品瓶恒温时间10min，加压时间0.3min，加压平衡时间0.3min，导入时间0.8min，导入平衡时间0.4min，进样时间0.5min ，进样针冲洗时间0.4min。

2.3 血储容器及试剂

血储容器枸橼酸钠1:9管（柠檬酸钠1:9）、EDTA-k2管、肝素钠管、枸橼酸钠1:4管（柠檬酸钠1:4）、氟化钠-草酸钾管全部选用江西赣达医疗器械有限公司生产的采血管。乙醇标准液浓度为100mg/100mL，乙醇标准品来自司法部司法鉴定技术研究所；叔丁醇标准品来自上海安谱科学仪器有限公司，内标液浓度40μg/mL。

2.4 样本的测定

测定按照公共安全行业标准《生物样品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、异丙醇和正丁醇的顶空气相色谱检验方法》（GA/T1073-2013）进行。采用内标曲线法定量，以叔丁醇为内标，标准曲线方程为：Y=0.0574386 X -0.0266151，Y为乙醇与叔丁醇的峰面积比值， X为乙醇工作溶液浓度（mg/100mL）。定量数据为FID2的数据，并对同一样品进行平行试验，结果取均值，双样相差不得超过5%。

2.5 统计学分析

数据采用Duncan氏新复极差法比较不同处理间的显著差异性，采用Excel 2013和SPSS20.0软件进行统计，并采用单因素方差分析和重复测量数据的方差分析。检测水准α≈0.05[10-11]。

3 结果与分析

3.1 血储容器的筛选

3.1.1 4～8℃冰箱冷藏下5种血储容器血液乙醇含量稳定性随时间的变化

如表1结果显示；5种管的血液乙醇含量检测结果有统计学意义。5种真空抗凝采血管中3d内血液乙醇含量基本没有变化，7d时前4种管基本无变化，与第5种管有显著性差异（P〈0.05）；14～28d内前3种管间无显著性差异，后2种管与前3种管之间有显著性差异（P〈0.05）。5种真空抗凝采血管作为血储容器时血液乙醇含量均随时间的延长而降低。EDTA-k2管、枸橼酸钠1:9管（柠檬酸钠1:9）、肝素钠管在14d内测试乙醇含量无显著性变化，14d后乙醇含量发生显著下降。氟化钠-草酸钾管在7d内测试乙醇含量结果稳定，7d后测试乙醇含量显著降低。而枸橼酸钠1:4管（柠檬酸钠1:4）在3d内测试乙醇含量无显著性变化，3d后测试乙醇含量明显降低。可见4～8℃冰箱冷藏下5种管中EDTA-k2管、枸橼酸钠1:9管（柠檬酸钠1:9）、肝素钠管这3种真空抗凝管为较佳血储容器。

表1 4～8℃下5种采血管中血液乙醇含量变化（mg/100mL）

3.1.2 -20℃下3种血储容器血液乙醇含量稳定性随时间的变化

在-20℃下条件下，以4～8℃冰箱冷藏下血液乙醇含量稳定性较好的3种真空抗凝管作为血储容器进一步筛选，3种管的血液乙醇含量检测结果有统计学意义。35d内3种真空抗凝管之间无显著性差异，42d后3种真空抗凝管之间均存在显著性差异（P〈0.05）。3种管的血液乙醇含量随储存时间的延长而降低，其中肝素钠管和枸橼酸钠1:9管在35d内血液乙醇含量较稳定，35d后明显降低，而EDTA-k2管在49d内血液乙醇含量稳定，无显著性变化。可见，-20℃冰箱冷藏时以EDTA-k2管为最佳血储容器，如表2所示。

表2 -20℃下3种采血管中血液乙醇含量变化（mg/100mL）

3.2 不同保存温度下血液乙醇含量稳定性的比较

不同保存温度下血液乙醇含量检测结果有统计学意义。如表3和图1所示，在3d内不同温度保存下血液乙醇含量结果稳定，无显著性变化；7～14d-20℃和4～8℃无显著性差异（P〉0.05），但与25℃和35～42℃具有显著性差异（P〈0.05）。4个温度保存下血液乙醇含量均随时间的延长而降低。-20℃温度下存储的血液乙醇含量在28d内结果比较稳定；4～8℃温度下存储的血液乙醇含量在14d内基本稳定，14d后显著下降（P〈0.05）； 25℃和35～42℃温度下存储的血液乙醇含量在3 d内基本稳定，3d后显著下降。可见，-20℃温度保存条件是血液乙醇含量测试保存血样的最佳温度条件。

3.3 -20℃下不同保存时间的血液乙醇含量及模型筛选

表3 不同保存温度下血液乙醇含量的变化（mg/100mL）

图1 不同保存温度下血液乙醇含量的变化趋势

表4 不同保存时间下血液乙醇含量的变化（mg/100mL）

从表4和图2可知，血液乙醇含量随保存时间的延长而下降。通过单因素方差分析发现，在90d内血液乙醇含量变化不大，90d后显著下降。可见酒驾血液样品的保存时效为90d。

图2 不同保存时间下血液乙醇含量变化动态

再利用Duncan氏新复极差测验法分析，发现在-20℃冰箱冷藏血液中乙醇含量变化最小。所以利用-20℃保存温度下血液乙醇含量随保存时间变化曲线做回归分析，得到-20℃保存温度下血液乙醇含量的回归方程，线性、二次、三次、复合、增长、指数函数6个的拟合优度都比较高，系数均满足显著性检验。但从数据趋势可知，三次函数更加符合实际情况，如表5和图3所示，乙醇含量随时间的延长而降低。保存时间越长的血液，乙醇含量降低速度越快，这表明当保存时间延长至某一时间时测定血液乙醇含量无统计学意义，90d为酒驾血液有效保存时间。

表5 -20℃保存温度下血液乙醇含量（y）随保存时间（x）变化曲线估计

图3 -20℃保存温度下血液乙醇含量的三次函数回归方程

4 讨论

针对国内以往对血储容器、保存温度、保存时间等影响血液乙醇含量的研究并未明确最佳条件的现状，本研究首先通过对现行的9种真空采血管中5种抗凝管先后在4～8℃和-20℃保存下进行选择性探究，发现在一定时间内4～8℃温度保存下肝素钠管、EDTA-k2管、枸橼酸钠1:9（柠檬酸钠1:9）管等3种采血管中的血液乙醇含量稳定性较好，进一步将此3种管作为血储容器采取相近血样后在-20℃温度保存，结果EDTA-k2管作为血储容器时其血液乙醇稳定性最好。随后以EDTA-k2管作为血储容器采取相近血样，探讨35～42℃、25～30℃、4～8℃、-20℃这4个温度保存下的血液乙醇含量，结果-20℃温度条件保存下血液乙醇含量检测结果稳定性最好。最后在血储容器和保存温度选择研究基础上，血样保存在EDTA-k2管中且在-20℃下保存180d，90d以内检测结果与最初的结果接近，90d以后检测结果与最初结果有偏差甚至偏差较大，经-20℃保存温度下血液乙醇含量随保存时间的回归分析中三次函数的回归方程拟合优度更高，认为90d为酒驾血液有效保存时间。从而确立了最佳血储容器为EDTA-k2真空抗凝采血管、最适保存温度为-20℃及有效保存时间为90d。

由于研究中采集的均是健康人鲜血，加之血储容器处于真空、密闭和抗凝状态，在研究的测试时间内可不考虑血液腐败、挥发和凝固所产生的影响[12]。至于实验检测中血液乙醇含量为何下降，有待于后期进一步研究。

5 结论

本研究通过实验证实了保存温度、血储容器、保存时间对血液乙醇含量检测结果的影响。研究结果显示，血液酒精测试最佳血储容器为EDTA-k2真空抗凝管，最适保存温度为-20℃，保存时效为90d。建议交管部门查验酒驾进行血液酒精检测时，以EDTA-k2管为血储容器，-20℃保存90d内送检，确保血液酒精含量检测结果的准确性，彰显我国司法的公平正义。