复方中草药对青脚麻鸡脾脏发育、抗氧化性及细胞增殖凋亡的影响

熊宪献， 刘 婷， 杨云龙， 孙 启， 金光明， 靳二辉

(安徽科技学院，安徽 凤阳 233100)

近年来，随着养殖业迅速发展，细菌耐药性、药物残留、环境污染等问题日趋严重，研发新型绿色安全的饲料添加剂，以减少抗生素的使用，已经成为畜禽养殖业可持续发展的迫切要求。中草药作为饲料添加剂具有资源丰富，毒副作用小、无耐药性、多靶点、多功效等独特优势，在畜禽生产中应用不仅可以防治疾病，促进畜禽生长，还可为动物补充营养物质，提高免疫力，改善肉品质及产品风味。如肉鸡日粮中添加乌梅、大青叶、柴胡等中草药能显著改善肉鸡胸肌的弹性、咀嚼性和亮度，提高肌肉品质[1]。日粮中添加连翘提取物、黄连素能够提高自由基清除能力、降低氧化应激，增加肠道有益菌群水平，改善肉鸡高饲养密度条件下的生长性能[2]。祁宏伟等[3]研究表明在AA肉鸡的基础日粮中添加750 mg的大豆提取物可显著促进肉仔鸡脾脏IFN-γ和IL-2 mRNA表达，提高机体免疫水平，增强机体特异性免疫功能。欧红萍等[4]研究显示，在饲料中添加1.0%复方中药“猪康散”可显著促进脾脏淋巴细胞增殖和降低脾淋巴细胞凋亡率，提高猪体免疫能力。

以上研究充分表明，在饲料中添加单一或复合中草药可一定程度上提高动物生产性能，增强机体免疫功能和抗氧化功能，改善肉品质，增强机体免疫力和抗病能力。然而，中草药种类繁多，不同中草药或中草药复方对动物机体生理功能的影响存在一定差异性，且中草药组方对肉鸡免疫器官细胞增殖凋亡的影响报道较少。脾脏是机体最大的周围淋巴器官，是免疫反应的主要场所，其在维持动物机体正常免疫功能中起着至关重要的作用。因此，本试验以青脚麻鸡为研究对象，通过添加自制的中草药组方，研究其对脾脏发育、抗氧化功能和细胞增殖凋亡的影响，为中草药资源开发及在畜禽养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物分组与饲养管理

选用400只刚出壳健康青脚麻鸡，购于凤阳县牧源家禽养殖专业合作社。按照体重相近原则随机分为对照组和3个复方中草药添加剂组(试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)，每组100羽(包含5个重复，n=20)。对照组饲喂未添加复方中草药的玉米-豆粕型基础日粮，试验Ⅰ-Ⅲ组分别按照0.5%、1.0%、1.5%的水平在日粮中添加复方中草药，采用层叠式笼养，自由采食和饮水，鸡舍温度、湿度和光照均按照肉鸡饲养标准进行控制。饲养试验持续56 d。按照常规肉鸡免疫程序对青脚麻鸡进行免疫接种。

1.2 复方中草药组成及主要有效成分含量

本试验添加的复方中草药组分主要包括金银花、黄连、蒲公英、紫花地丁、黄芪和甘草。采用超微粉碎机逐一粉碎后按比例混匀。采用分光光度法和液相色谱法检测主要有效成分为：总多糖1.86%，总黄酮25.63%，黄连素1 009.23 mg/kg。

1.3 基础日粮

本试验中青脚麻鸡饲喂的基础日粮配方及营养成分参照经典的方法进行配制和检测[5]。

1.4 样本采集与处理

分别于28和56日龄，每组随机选取青脚麻鸡15羽(每个重复3羽)，禁食12 h，称重后颈动脉放血致死，迅速解剖分离脾脏，一部分经液氮冷冻后，置于-80 ℃冰箱保存，另一部分固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中。

1.5 脾脏重量和指数测定

青脚麻鸡致死后，逐项分离气管、食道、嗉囊、肠、脾脏、胰腺、胆、生殖器官，再逐项分离头、爪、心、肺、肝、肾、腺胃、肌胃以及腹部脂肪，称量全净膛重。脾脏指数=脾脏重量(g)/全净膛重(g)×100%。

1.6 石蜡切片与HE染色

脾脏固定好后，采用常规技术制作，切片厚6 μm，HE染色后用于显微观察、拍照和测量。每个脾脏组织取20 张切片，用正置显微摄影系统(麦克奥迪BA410)观察组织结构。

1.7 脾脏抗氧化功能的测定

脾脏于-80 ℃取出后称重，加入适量冰生理盐水，电动匀浆机匀浆，3 000 rmp/min离心15 min取上清液，分别选用总抗氧化能力(T-AOC)、GSH-Px、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和MDA测定试剂盒测定脾脏抗氧化能力。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.8 脾脏细胞增殖和凋亡的测定

脾脏于-80 ℃取出后，按照RNA提取试剂盒(天根，DP431)说明书进行总RNA提取。总RNA用全自动蛋白核酸分析仪检测浓度和质量，反转录试剂盒(Thermo，K1622)合成cDNA。按照 Green Premix Ex TaqTMKit说明书在Roche Light Cycler 480II进行(Basel，Switzerland)实时荧光定量PCR扩增。所用引物引物序列及退火温度见表1。基因的相对表达采用2-ΔΔCt的方式进行计算和分析。

表1 凋亡、增殖相关基因引物序列

1.9 数据处理

应用SPSS 22.0数据分析软件对数据进行正态分布检验和单因素方差分析，不同处理组数据之间差异性采用LSD法进行多重比较，P<0.05表示显著差异。试验数据均用“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 脾脏重量与指数

由表2知，28日龄时，试验Ⅰ组脾脏重量和指数与对照组相比显著升高31.25%和22.73%(P<0.05)；试验Ⅱ组脾脏指数与对照组相比显著升高18.18%(P<0.05)。56日龄时，试验Ⅱ组脾脏重量与对照组相比显著升高36.76%(P<0.05)。

表2 复方中草药对青脚麻鸡脾脏重量与指数的影响

注：同一行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.2 脾脏显微组织结构观察

由图1所示，28日龄时，对照组脾脏显微组织结构正常，白髓和红髓结构清晰，脾小结和动脉周围淋巴鞘界限明显，体积较大(图1A)。与对照组相比，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组脾显微结构更加清晰，脾小结增多，体积增大，动脉周围淋巴鞘面积增大(图1C和1E)；试验Ⅲ组脾小结较小，脾动脉周围淋巴鞘无明显变化(图1G)。

56日龄时，对照组脾脏组织结构清晰，脾中白髓和红髓分界明显，脾小结和脾动脉周围淋巴鞘明显增大，其内淋巴细胞排列密集(图1B)。与对照组相比，试验Ⅰ和Ⅱ组脾小结数量明显增多，体积有所增大，脾动脉周围淋巴鞘细胞排列紧密，面积增大，其中试验Ⅱ组明显增大(图1D和1F)。Ⅲ组脾小结和动脉中周围淋巴鞘变化不明显，但淋巴细胞排列较为疏松(图1H)。

A-B：对照组；C-D：试验Ⅰ组；E-F：试验Ⅱ组；G-H：试验Ⅲ组；A, C, E, G：28 d；B, D, F, H：56 d

2.3 脾脏抗氧化功能

由图2知，28日龄时，试验Ⅱ组和试验Ⅲ组脾脏MDA含量与对照组相比显著降低22.13%和22.40%(P<0.05)。56日龄时，试验Ⅱ组脾脏MDA含量与对照组相比显著降低23.15%(P<0.05)；试验Ⅱ组和试验Ⅲ组脾脏GSH-Px含量与对照组相比显著升高23.13%和21.76%(P<0.05)。

图2 复方中草药对青脚麻鸡脾脏抗氧化功能的影响

2.4 脾脏增殖和凋亡

由图3可知，28日龄时，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组脾脏PCNA mRNA表达与对照组相比显著升高10.32%和14.91%(P<0.05)。56日龄时，试验Ⅱ组脾脏PCNA mRNA表达与对照组相比显著升高22.31%(P<0.05)；试验Ⅱ组脾脏Caspase-3 mRNA表达与对照组相比显著降低27.82%(P<0.05)。

图3 复方中草药对青脚麻鸡脾脏增殖凋亡的影响

3 结论与讨论

脾脏含有丰富的免疫活性细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。脾脏的良好发育对提高动物的免疫功能有着重要的作用，而器官的重量和指数以及显微组织结构变化能够在很大程度上反映器官的生长发育状况。金光明等[6]研究发现，饲料中添加黄芪、板蓝根、炒白术等组成的复方中草药能够明显促进脾脏的发育，使脾组织结构中红髓与白髓结构更加清晰，脾小结明显增大。郭剑英等[7]研究报道，饲料中添加1.0%和1.5%由生黄芪、当归、山楂等组成的复方中草药能显著提高小鼠脾脏指数，促进脾脏的发育。本研究也显示，日粮中添加1.0%的复方中草药能显著提高脚麻鸡28 d脾脏指数和56 d脾脏重量，改善脾脏组织结构。添加0.5%的复方中草药也能显著提高28 d青脚麻鸡脾脏重量和指数。这表明日粮中添加0.5%和1.0%的复方中草药均能促进脾脏发育，这与前人的研究结果一致，其原因可能是中草药中含有丰富的营养物质，能促进机体的消化吸收，进而为脾脏的生长发育提供充足的营养。

动物机体的快速生长发育和较高的营养代谢会使机体产生大量的自由基。这些自由基可使细胞膜结构产生严重损伤，使细胞功能紊乱[8]。其中，GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，能够特异性催化GSH产生GSSG，还原过氧化物，保护细胞膜结构和功能完整；T-SOD是生物体内清除自由基的首要活性物质，其活力对机体氧化与抗氧化平衡起至关重要作用；MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，是常用的细胞膜脂质过氧化检测指标，其含量可以反映器官细胞脂质过氧化程度，间接反映细胞损伤情况；T-AOC是动物体内主要的抗氧化能力检测指标，其活性可以反映机体抗氧化作用强弱及各抗氧化体系之间协调情况[9]。因此，通过检测器官中MDA含量可以反映器官过氧化情况，检测GSH-Px、SOD和T-AOC含量或活性可反映器官的抗氧化功能[10]。显示，许多中草药能够显著提高动物机体的抗氧化能力。相关研究表明，饲料中添加1.0%黄芪、枸杞、金银花等组成的复方中草药能显著提高胸肌T-AOC和GSH-Px活性，并降低胸肌和腿肌MDA含量，提高胸肌和腿肌的抗氧化能力[11-13]；王翠菊等[11]研究显示，饲料中添加适量的黄芪多糖可以显著提高蛋鸡血清中SOD和GSH-Px活性，降低血清中MDA含量，进而提高机体抗氧化能力[14]。本试验结果也显示，日粮中添加1.0%复方中草药可显著提高56 d青脚麻鸡脾脏GSH-Px含量，显著降低28 d和56 d脾脏MDA含量；添加1.5%的复方中草药也能显著提高56 d脾脏GSH-Px含量，显著降低28 d脾脏MDA含量。这表明日粮中添加1.0%和1.5%的复方中草药均能显著提高脾脏抗氧化能力。分析其主要原因，可能是由于本研究所用复方中草药中所含的多糖成分能够增强脾脏中抗氧化酶的活性，减少氧自由基的数量，从而提高脾脏的抗氧化能力。这与徐小芳等[15]研究的结果一致，中草药多糖能够显著提高鸡血清中SOD、GSH-Px、CAT、GR活性，降低MDA含量，提高机体抗氧化能力。本试验中草药中还含有总黄酮等活性物质，其中隋洪玉等研究发现，蒲公英总黄酮还可提高衰老小鼠脑组织内SOD活性，降低MDA含量，抑制神经元和神经胶质细胞发生脂质过氧化反应，从而抑制自由基对其自身的损害[16]。

细胞的增殖和凋亡是调控细胞正常生命活动的两个重要细胞内事件，许多体内外因素均可通过诱导细胞内增殖或凋亡相关基因的表达，进而影响细胞的增殖或凋亡及其最终命运[17]。脾脏淋巴细胞的增值和凋亡对其组织结构及免疫功能可产生重要的作用。细胞核增殖抗原(PCNA)又称周期素，是DNA聚合酶δ的一种辅助蛋白，其与细胞的DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起着关键作用，是反映细胞增殖状态的良好指标[18]。Caspase-3是细胞凋亡过程中执行最终凋亡的最主要分子，其表达水平对细胞凋亡的过程可产生重要作用[19]。同时，相关研究发现，许多中草药及提取物均能促进机体细胞增殖，抑制细胞凋亡。贺旭等[20]研究表明，通过向大鼠颈总动脉灌注三七总皂苷，使Bcl-2和Bax阳性细胞和蛋白水平的比值增加，同时减低Caspase-3表达，从而使减少大鼠全脑缺血后海马CA1区神经元凋亡数量。赵盛云等[21]研究显示，由党参、白术、茯苓、甘草制成的煎剂灌胃大鼠，能够抑制脾虚证模型大鼠胃粘膜细胞Caspase-3表达，进而减少胃黏膜疾病的发生。本试验结果也显示，日粮中添加1.0%的复方中草药可明显促进28 d和56 d脾脏PCNA mRNA的表达，抑制56 d脾脏Caspase-3 mRNA的表达；添加0.5%的复方中草药能显著提高28 d脾脏PCNA mRNA的表达。这说明日粮中添加不同剂量的复方中草药能不同程度的促进脾脏细胞增殖，抑制脾脏细胞凋亡。其原因可能是由于本复方中草药成分中的甘草，甘草具有抗损伤、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用，同时Zhou等[22]研究发现甘草提取物能显著降低大鼠海马区细胞Bax/Bcl-2蛋白比率、Caspase-3和Cyt-C蛋白的表达，保护大鼠海马神经元免受损伤。

综上所述。日粮中添加1.0%的复方中草药对青脚麻鸡脾脏发育、抗氧化功能和细胞增殖具有显著促进和增强作用，对细胞凋亡具有明显的抑制作用。