自拟通络祛浊方对两种不同方法诱导大鼠非酒精性单纯性脂肪肝模型的干预效果及机制研究

金 毅，吕爱贞，黄宝明，邢 伟，郑又铭，张金龙，杨 雯，徐愉林，李 静

[1. 深圳市药品检验研究院(深圳市医疗器械检测中心)深圳药品质量标准研究重点实验室，广东 深圳 518057；2. 广东东阳光药业有限公司东阳光科技园药理部，广东 东莞 523000)

非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver，NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以及肝硬化等，均属于非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的疾病谱[1]。随着NAFL发病率逐年增高，日趋年轻化，NAFL的防治受到重视，并从动物模型、细胞模型等多种方法研究[2-4]。但是，至今其发病机制尚不清楚，西医无确切有效的治疗方法，而中医药在临床上可获得较好的疗效[5]。

中医理论认为，NAFLD患者多为饮食不节，肥甘厚腻易积聚在脾胃，或者是情志不畅，肝络受阻，多为自拟中药复方进行治疗，效果明显[6]。本研究基于驱除体内气血瘀滞的“通络”和清除病理代谢废物的“祛浊”理论，采用对NAFLD患者有明显临床疗效的自拟通络祛浊方，以防未病的理念，选择国家食药监总局颁布的保健食品配方中药食同源的西洋参、麸炒白术、肉桂等6味中药，观察自拟通络祛浊方对四氯化碳(tetrachloride，CCl4)化学性肝损伤或高脂饲料诱导的大鼠NAFL模型的干预效果，初步探讨作用机制。

1 材料

1.1 实验动物健康清洁级SD大鼠，SPF级，♂，体质量(160～180) g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物质量合格证号：43004700039398、43004700035190，生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002。动物饲养于广东东阳光药业有限公司东阳光研究院屏障环境动物实验室，在(20～26) ℃和40%～70%湿度下饲养，采用昼夜各12 h间断照明(实验动物福利伦理审查号 IAEC-K-170712-01)。自拟高脂饲料配方的成分为基础饲料50%、豆粉12.5%、蛋黄粉12.5%、猪油10%、蔗糖10%、奶粉5%、浓鱼肝油10滴/100 g(委托广东省医学实验动物中心配制)。

1.2 药物共计6味中药配方颗粒(中药配方颗粒购自广东一方制药有限公司，批号：7071421、7072401、7070651、7072701、7060201、7070061)，溶于40 ℃纯净水，保证最大灌胃容积<2 mL，采用本项目组已发表论文[7]中的有效给药剂量，即西洋参0.75 g·kg-1、麸炒白术1.5 g·kg-1、肉桂0.25 g·kg-1、桃仁1.0 g·kg-1、麸炒枳壳0.5 g·kg-1、三七0.65 g·kg-1。

1.3 试剂CCl4(AR级，阿拉丁公司，批号：E1625074)；戊巴比妥钠(北京化学试剂公司，批号：060222)；组织固定液(B型，中山市康乃欣生物医疗科技有限公司，批号：20170925)；无水乙醇、二甲苯(分析纯，广州化学试剂厂)；苏木精染色液(批号：717094)、伊红染液(批号：717063)，购自珠海贝索生物技术有限公司；谷丙转氨酶(alanine transaminase， ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、甘油三酯(triglyceride，TG)、胆固醇(cholesterol，CHO)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein， LDL)检测试剂盒，均购自Roche公司；非那西汀(批号：WXBC1218V)，购自阿拉丁；双氯芬酸钠(批号：100334-200302)，购自中国食品药品检定研究院；丁呋洛尔(批号：1-EJB-67-6)，购自TRC；安非他酮(批号：100671-200301)，购自中国药品生物制品检定所；紫杉醇(批号：130326)，购自上海康标化学有限公司；普萘洛尔(纯度>99.0%，批号BCBQ4523V)，购于美国Sigma公司；色谱柱(XbridgeTMC18，5 μm，2.1 mm×150 mm)，购于Waters公司。

1.4 仪器冷冻研磨仪(上海静信实业发展有限公司)；VIP-5HR脱水机(樱花医疗科技泰州有限公司)；EC360包埋机、半自动HM1401切片机(德国美康国际)；HMS740全自动染色机(IKA公司)；烤片机(Stretching Tables，MICOM，德国)；cobas c311罗氏全自动生化分析仪(德国罗氏公司)；IKA T10B 手持匀浆机(德国IKA公司)；5810R冷冻离心机(德国Eppendorf 公司)；AB sciex 4500质谱仪(美国AB SCIEX公司)；Agilent 1200型高效液相色谱仪、6530-QTOF四极杆飞行时间质谱(美国Agilent公司)。

2 方法

2.1 两种实验动物模型的建立CCl4模型组大鼠每周2次皮下注射含有40% CCl4的橄榄油，溶媒组皮下注射橄榄油，剂量均为2 mL·kg-1，直至实验结束[8]。高脂饲料模型组每天给予高脂配方饲料，空白对照组给予基础饲料。

2.2 分组及给药方法CCl4诱导NAFL模型实验分为溶媒组、CCl4模型组及通络祛浊方预防组(简称预防组)，该模型成功率高，每组5只；高脂饲料诱导NAFL模型实验分为空白对照组、高脂饲料模型组及预防组，每组10只。两个预防组从实验初始，在和模型组相同条件造模的同时，每天灌胃给予通络祛浊方。CCl4诱导NAFL模型实验在实验第4周末结束，高脂饲料的实验在第9周末结束。

2.3 血生化检测实验结束时，各组大鼠禁食不禁水16 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠(2 mL·kg-1)麻醉，腹主动脉采血，4 ℃、3 500 r·min-1离心15 min，取血清，检测ALT、AST、TG、CHO、HDL和LDL。

2.4 肝脏脂质检测剖取肝脏后，剪取新鲜肝组织，经无水乙醇匀浆，离心取上清，测TG及CHO的浓度，计算肝内TG及CHO的含量。

2.5 组织病理学检查剩余肝脏放入福尔马林溶液中固定7 d，取材，脱水浸蜡，包埋，切片3～5 μm，HE常规染色后，光学显微镜下观察[7]。

2.8 代谢组学测定及分析方法取血浆样品，涡旋震荡30 s，取100 μL样品，加入甲醇-乙腈(1 ∶1)300 μL，再加入10 μL内标工作液，涡旋5 min混匀，18 000×g离心5 min，取上清200 μL，使用HPLC-6530Q-TOF液质联用系统采集，后续经MassHunter，XCMS online处理及校正质谱数据，使用Metaboanalyst4.0形成PCA及sPLS-DA模型，使用Prism 7.0，Two way ANOVA (Tukey's multiple comparisons test)进行统计学分析[9-10]。主要使用KEGG分析代谢通路。

3 结果

3.1 通络祛浊方有效改善肝脏脂肪变性

3.1.1通络祛浊方对CCl4诱导的NAFL模型的干预效果明显 CCl4模型组与溶媒组比较，肝脏表面色泽发黄，体积、重量增加。Fig 1的组织病理学观察，溶媒组未见异常；模型组可见肝细胞广泛的大泡性空泡样改变，符合目前国际公认的NAFL的病理学诊断标准，确认CCl4诱导的NAFL模型造模成功[1, 11]。与模型组比较，预防组的肝细胞空泡样变的程度明显的减轻。

3.1.2通络祛浊方对高脂饲料诱导的NAFL模型有改善作用 大体观察，与空白对照组比较，模型组肝脏表面色泽发黄，重量增加。Fig 2的组织病理学观察发现，空白对照组未见异常；模型组可见大空泡性脂肪变性，确认造模成功；与模型组比较，预防组空泡样变的数量减少，病变程度减轻。

3.2 通络祛浊方明显降低NAFL模型中肝内脂质含量和肝脏质量

3.2.1通络祛浊方明显降低CCl4诱导的NAFL模型的肝内TG和肝指数 Tab 1结果显示，与溶媒组相比，CCl4模型组大鼠肝内TG含量明显增加(P<0.01)，预防组明显降低肝内TG含量(P<0.05)。与溶媒组相比，模型组大鼠肝重、肝脑比均明显增加(P<0.05)，预防组两者均有下降趋势。

Fig 1 Histopathological changes in liver of NAFL rats established by CCl4, intervention group and vehicle group(HE staining,×100)

A:Vehicle group; B:NAFL group; C:Intervention group.

Fig 2 Histopathological changes in liver of NAFL rats established by a high-fat diet, intervention group and control group(HE staining,×200)

A:Control group; B:NAFL group; C:Intervention group.

3.2.2通络祛浊方明显降低高脂饲料诱导的NAFL模型的肝内TG、CHO及肝指数 与空白对照组相比，高脂模型组肝内TG及CHO含量明显增加(P<0.01)，预防组肝内TG和CHO含量有降低趋势。模型组肝重有升高的趋势，肝脑比明显增加(P<0.05)；与模型组相比较，预防组肝脑比有下降趋势(Tab 1)。

3.3 通络祛浊方对动物NAFL模型的血脂具有双向调节作用

3.3.1通络祛浊方对CCl4诱导的模型中病理性降低的血脂有上调作用 与溶媒组相比，模型组血中TG、CHO、HDL及LDL均呈降低趋势，特别是LDL差异有统计学意义(P<0.01)。预防组对血中的TG、CHO有升高趋势(Tab 2)。

3.3.2通络祛浊方对高脂饲料诱导的模型中病理性上升的血脂有下调作用 高脂饲料喂养9周后，与空白对照组相比，模型组血中TG明显升高(P<0.01)；预防组将血中TG降至正常水平(P<0.05)。模型组血中CHO、HDL及LDL有下降的趋势，预防组一定程度回升HDL及LDL(Tab 2)。

3.4 通络祛浊方明显恢复CCl4诱导的NAFL模型中CYP酶活性如Fig 3所示，与溶酶组比较，CCl4模型组各亚酶活性均明显下降(P<0.01)，预防组各亚酶活性明显回升，除CYP1A2之外，差异均有统计学意义。而在高脂饲料诱导的NAFL模型中，主要微粒体亚酶活性与空白对照组比较，无明显改变。

3.5 通络祛浊方对NAFL模型干预治疗的代谢组学分析结果

Tab 1 Changes of hepatic lipids, organ weight and liver index in each group of NAFL rats established by CCl4 or a high-fat diet

*P<0.05,**P<0.01vsvehicle or control;#P<0.05vsNAFL model

Tab 2 Changes of blood lipids in each group of NAFL rats established by CCl4 or a high-fat diet/mmol·L-1

**P<0.01vsvehicle or control;#P<0.05vsNAFL model

Fig 3 Changes of CYP enzyme activity in NAFL rats established by CCl4(A) or a high-fat diet(B)

**P<0.01vsvehicle group;#P<0.05,##P<0.01vsNAFL model group

3.5.1化学计量学分析 本研究使用PCA模型观察系统性偏差范围。质控样品(quality control，QC)均紧密聚集，说明在不同时间点系统稳定(Fig 4A)。CCl4模型组、预防组与溶媒组能够基于血浆代谢产物相互分离，各组样本之间存在系统性差异；而高脂模型组与预防组的95%置信限有一定重叠，两组在代谢产物上有一定的相似特征(Fig 4B、4C)。

3.5.2关键代谢产物 CCl4诱导NAFL模型中，共筛选出6个重要的代谢产物，包括4个磷脂类物质，LysoPE(0 ∶0/14 ∶1(9Z))、PG(15 ∶1(9Z)/0 ∶0)、PG(13 ∶0/0 ∶0)、PC(16 ∶0/22 ∶5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))，以及1个氨基酸类物质，4-胍基丁酸(4-guanidinobutanoic acid)；1个不饱和脂肪烃类，1,3-辛二烯(1,3-octadiene)。以上代谢产物存在相同的变化趋势，其中PG(15 ∶1(9Z)/0 ∶0)在溶媒组和模型组间差异有统计学意义，并且预防组恢复至溶媒组水平。同时，本实验中，亦可见亚油酸及PC(0 ∶0/18 ∶0)在CCl4诱导NAFL模型组明显下降(P<0.01)，并在预防组恢复至溶媒组水平(Fig 5A)。

高脂饲料诱导的NAFL模型的6个关键代谢产物包括3个有机酸类，(2E,4Z)-2-羟基粘康酸[(2E,4Z)-2-hydroxymuconic acid]、(E)-4-(三甲基季铵)丁-2-烯酮[(E)-4-(trimethylammonio)but-2-enoate]、2,3-羟基丁酸(2,3-dihydroxybutanoic acid)；1个反式油酸酰胺，即脂肪酰胺(elaidamide)；1个脂肪烃类化合物，19碳-3Z,6Z,9Z-三烯(3Z,6Z,9Z-eicosatriene)；1个磷脂类化合物，PC(20 ∶1(11Z)/0 ∶0)。其中，2,3羟基丁酸在模型组与空白对照组之间差异有显著性，但预防组未完全恢复至空白对照组水平(Fig 5B)。

Fig 4 sPLS-DA score plot of metabolites

A:PCA model covering QC samples; B:sPLS-DA score plot of metabolites of NAFLD rats established by CCl4; C:sPLS-DA score plot of metabolites of NAFLD rats established by a high-fat diet. The ellipse around the periphery of each group of samples represents the 95% confidence limit.

Fig 5 Relative content of key circulating metabolites among groups

A:Relative content of key circulating metabolites among groups in NAFL rats established by CCl4(1.4-Guanidinobutanoic acid; 2. LysoPE(0 ∶0/14 ∶1(9Z))； 3. PG(15 ∶1(9Z)/0 ∶0)； 4. 1,3-Octadiene; 5. PG(13 ∶0/0 ∶0); 6. PC(16 ∶0/22 ∶5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)); 7. PC(0 ∶0/18 ∶0); 8. Linoleic acid); B:Relative content of key circulating metabolites among groups in NAFL rats established by a high-fat diet(1. (2E,4Z)-2-hydroxymuconic acid; 2. (E)-4-(trimethylammonio)but-2-enoate; 3. 2,3-dihydroxybutanoic acid；4. PC(20 ∶1(11Z)/0 ∶0); 5. Elaidamide; 6. 3Z,6Z,9Z-eicosatriene; 7. PC(0 ∶0/18 ∶0); 8. Linoleic acid).**P<0.01vsvehicle group;#P<0.05,##P<0.01vsNAFL model group.

4 讨论

NAFLD较为主流的发病机制理论为“二次打击”学说，即第1次“打击”指脂肪酸和甘油三酯在肝细胞内的沉积，引起非酒精性单纯性脂肪变性(NAFL)；第2次“打击”造成肝脏炎症，肝纤维化，甚至发展为肝硬化和肝癌[12]。NAFL尚属可逆性病变，而炎症及纤维化阶段的临床治疗及病理学改变均较难恢复。因此，运用中医防未病思想和通络、祛浊理论干预，发现通络祛浊方明显降低两种不同方法诱导大鼠NAFL模型肝细胞内脂质含量，一定程度降低肝脏质量和肝指数，对血脂有双向调节作用，提示通络祛浊方可作为预防干预NAFL的有效手段，改善肝脂肪变性，减缓NAFL的进展。

CYP酶活性在CCl4诱导的NAFL模型中明显降低，预防组对各亚酶活性均有明显提升，提示CYP酶是CCl4引发肝损伤的重要因素，与传统的CCl4肝损伤机制相吻合。因此，CYP酶活性是通络祛浊方干预效果的重要途径，可作为观察指标之一。在高脂饲料诱导的NAFL模型中，CYP酶活性几乎无改变，说明不是高脂饲料诱导NAFL的因素，亦不参与通络祛浊方干预作用。

虽然CCl4或高脂饲料诱导的大鼠NAFL模型均能观察到相似的肝脏病变，但代谢组学结果显示，这两种不同方法引起的代谢产物变化不同。CCl4诱导的大鼠NAFL模型与磷脂类物质含量相关。在脂肪沉积于肝脏无法转运至外部时，血中的磷脂类物质下降，并在预防组逐渐恢复至溶媒组水平，提示可能与脂代谢通路(glycerophospholipid metabolism)异常相关。由于肝脏大量脂类物质的蓄积，大量游离的脂类及脂肪酸类蓄积于肝脏，磷脂的上游合成原料，包括含有十六碳支链磷脂结构的上游原料，例如十六烷酸等被消耗，导致血中游离磷脂类含量下降。除磷脂类外，氨基酸类物质胍基丁酸(guanidinobutanoic acid)及脂肪烃类物质辛二烯(1,3-octadiene)也呈下降趋势，其中胍基丁酸是精氨酸及脯氨酸代谢的关键下游产物。精氨酸对促进机体捕获氨，并通过形成尿素的方式降低血中氨水平起到重要作用。胍基丁酸的下降，提示精氨酸代谢减弱，肝脏合成尿素的能力下降，排毒功能减弱。而游离辛二烯及磷脂的降低，可能与肝脏脂质蓄积导致其生物合成原料减少有关。在高脂饲料诱导的NAFL模型中，主要出现呈上升趋势的代谢产物是游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)、脂肪酰胺、脂肪烃以及磷脂[13]。FFA占比最大(42.86%)。FFA的主要作用是作为载体，为三羧酸循环提供酰基。辅酶A(coenzyme A，CoA)在乙酰转移酶的作用下，通过FFA获得酰基，转化成乙酰-CoA，然后进入三羧酸循环。作为体内能量代谢的核心环节，三羧酸循环上游的变化也提示体内能量代谢的异常，而FFA的来源主要是中性脂肪降解。结果提示，在脂肪大量摄取时，除了肝脏脂肪蓄积及游离的TG增加，血中主要增加的是脂类的降解产物FFA，说明机体摄入胺类过多，但捕获氨的能力不足以完全排除这些额外的胺类，机体通过精氨酸、鸟氨酸代谢捕获氨，并生成尿素的反应不足以排除血中过多的游离胺类，从而提示NAFL肝功能下降。

综上所述，通络祛浊方对两种不同因素诱导的大鼠NAFL模型具有较明显的保肝降脂的干预效果，但在不同方法诱导的NAFL中发挥干预作用的机制不同。

(致谢：本实验在广东东阳光药业有限公司东莞东阳光科技园药理部完成，感谢大力支持及协助！)