丹酚酸B诱导血管新生和缓解氧化应激对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤的保护作用①

吕 娟 赵红梅 孙桂芳 王润青

(郑州市中心医院神经内科，郑州 450000)

脑卒中是脑部血管破裂或血管柱塞导致脑损伤的一种急性脑血管疾病，具有高发病率、高死亡率和高致残率[1]。2015年的调查报告显示，全球约有4 000 万脑卒中患者，造成600万人死亡，是仅次于冠状动脉的第二大致死疾病[2]。目前治疗手段主要有抗血小板、静脉溶栓、动脉溶栓和取栓，血管成形和支架植入[3]。许多实验证明神经保护剂、抗氧化剂通过对抗活性氧或抑制兴奋性神经递质，减少由缺血引起的组织损伤，然而到临床期，所有的药物都宣告失败[4]。丹参是著名的传统中药材，广泛地应用于治疗各种心血管疾病[5]。丹参的主要有效水溶性成分是丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)和二羟基苯基乳酸[6]。研究显示，丹酚酸B能减弱白细胞对肝窦性的黏附性，抑制嗜中性内皮细胞黏附，抑制内皮细胞中细胞间黏附分子1(Intercellular adhesion molecular 1，ICAM-1)的表达[7]。丹酚酸B通过抑制核因子b的激活，减弱了内皮细胞ICAM-1和血管细胞黏附分子1的表达[8]。另外许多研究证实，丹酚酸在氧化应激和癌症治疗方面发挥作用[9,10]。但是丹酚酸B对脑缺血再灌注的影响还鲜有研究。本文将探究丹酚酸B对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 丹酚酸标准品(115939-25-8)购自源叶生物；SD大鼠购自广东医学实验动物中心；HE染色试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天；总超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒购自上海纪宁生物；丙二醛(Malonaldehyde，MDA)和乳酸脱氢酶(Lactate dehyderogenase，LDH)检测试剂盒购自上海酶联生物；免疫组化SP试剂盒购自默沙克生物；Ripa裂解液购自索莱宝生物科技公司；ICAM-1、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、VEGFR2、P38、p-P38、p-热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)27兔抗大鼠一抗购自Abcam；辣根过氧化物酶标记二抗及DAB显色液购自上海羽朵生物。

1.2实验方法

1.2.1小鼠分组及模型建立 SD大鼠实验前，适应环境一周。将40只SD大鼠分成4组：健康组(Ctrl)；加药组：健康大鼠腹腔注射丹酚酸B 50 mg/kg体重；模型组：参考文献建立局灶性脑缺血再灌注(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型；模型加药组：模型大鼠腹腔注射丹酚酸 B 50 mg/kg体重。加药组和模型加药组大鼠在建模前3 d 腹腔注射给药，每天1次，再灌注2 h时再次给药；健康组和模型组大鼠腹腔注射等量的生理盐水；大鼠在再灌注24 h后处死。根据Longa提出的可逆性大脑中动脉闭塞线栓法制作局灶性脑缺血再灌注大鼠模型。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，颈正中切口暴露颈总动脉、颈外动脉和翼腭动脉，将单丝尼龙线由颈总动脉插入，栓塞左侧大脑中动脉，缺血2 h后，取出尼龙线，24 h再灌注。模型成功的标志是大鼠右侧肢体瘫痪，站立不稳。

1.2.2HE染色 大鼠用4%的多聚甲醛灌注后取脑，10%中性福尔马林固定，常规方法石蜡包埋，切片。二甲苯脱蜡，梯度乙醇洗脱，最后加入蒸馏水。苏木素溶液处理5 min，自来水洗，70%和90%乙醇脱水各10 min，酒精伊红染色液染色3 min；切片经无水乙醇脱水，经二甲苯透明后，中性树胶封固。光学显微镜下观察并拍照。

1.2.3TUNEL染色 常规方法石蜡包埋、脱蜡、至水。切片用二甲苯处理后，梯度乙醇洗脱，加蛋白酶K 室温水解15 min，蒸馏水洗。加含2%过氧化氢的PBS室温处理5 min，PBS清洗；加TDT酶反应液，湿盒中反应1 h；加反应终止液，PBS清洗，加过氧化物酶标记的抗体，DAB显色，苏木素复染；二甲苯脱水，封片，干燥后在光学显微镜下观察并拍照。

1.2.4免疫组化 石蜡切片用3%乙酸灭活内源性酶，高温加热修复抗原；加山羊血清封闭，加PBS稀释好的抗体，37℃孵育2 h,PBS清洗后，加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育30 min；DAB显色；用含1%的Tween 20的PBS清洗；苏木素复染，加碱性缓冲液返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察并拍照。使用软件Image J分析ICAM-1阳性细胞的面积，计算阳性细胞的百分比。

1.2.5Western blot 取组织细胞至含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液中，4℃下处理1 h，离心取上清。用BCA法测定蛋白浓度，加上样缓冲液制作蛋白样品。同等量的蛋白样品用12%的变性蛋白凝胶分离，转膜，5%BSA的封闭液常温封闭1 h，加一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5 min；加二抗室温下孵育2 h，TBST洗膜后，加显色液，凝胶成像仪中观察并拍照。

1.3统计学分析 用统计学软件SPSS16.0处理实验数据，多组间比较使用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1丹酚酸B缓解局灶性脑缺血再灌注诱导的大鼠脑组织的损伤 加药组与健康组相比，MCAO大鼠脑组织没有出现明显变化，神经细胞、胶质细胞和脑血管形态正常，结构完整，核仁清晰(图1)。模型组与对照组相比，大量神经细胞失去完整结构，细胞周围明显肿胀，部分出现坏死后形成的空泡(图1)。模型组加药处理后，细胞排列明显规则，层次清晰，细胞结构正常(图1)。

2.2丹酚酸B抑制局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织细胞凋亡 模型组与对照组相比较，TUNEL染色呈阳性的细胞数量显著上升(图2，P<0.01)。模型加药组与模型组相比较，发生凋亡的细胞比例显著降低(图2，P<0.01)。

2.3丹酚酸B抑制局灶性脑缺血再灌注诱导的氧化应激反应 模型组与对照组相比，脑组织中SOD的活性显著降低，MDA和LDH的含量显著上升(图3，P<0.01)。模型加药组与模型组相比，SOD活性显著上升，MDA和LDH的含量显著降低(图3，P<0.01)。

图1 丹酚酸B对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织病理损伤的影响Fig.1 Effect of Salvianolic acid B on pathological damage in focal cerebral ischemia reperfus-ion rats

图2 丹酚酸B对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of Salvianolic B on cell apoptosis in MCAO ratsNote：*.P<0.01 vs Ctrl group,#.P<0.01 vs MCAO group.

2.4丹酚酸B降低局灶性脑缺血再灌注诱导的炎症反应 免疫组化结果显示，模型组与对照组相比较，大鼠脑组织中ICAM-1的蛋白表达明显上调(图4，P<0.01)。模型组大鼠注射丹酚酸B后，大鼠脑组织中ICAM-1的表达显著下调(图4，P<0.01)。

2.5丹酚酸B诱导MCAO大鼠脑组织损伤部位血管生成 模型组与对照组相比，大鼠脑组织VEGF及VEGFR2的表达显著下调(图5，P<0.01)。模型加药组与模型组相比，大鼠脑组织VEGF和VEGFR2的表达显著上调(图5，P<0.01)。

2.6丹酚酸B促进P38和Hsp27的磷酸化激活 Western blot 结果显示，各组之间P38和Hsp27表达总量差异无显著统计学意义(图6，P<0.01)。模型组与对照组相比较，磷酸化P38和磷酸化Hsp27的表达显著下调(图6，P<0.01)。模型加药组与模型组相比较，磷酸化P38和磷酸化Hsp27的表达显著上调。

图3 丹酚酸B对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织氧化应激反应的影响Fig.3 Effect of Salvianolic B on oxidative stress response in MCAO ratsNote：*.P<0.05 vs Ctrl group,#.P<0.05 vs MCAO group.

图4 丹酚酸对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织ICAM-1表达的影响Fig.4 Effect of Salvianolic B on expression of ICAM-1 protein in MCAO ratsNote：*.P<0.05 vs Ctrl group,#.P<0.05 vs MCAO group.

图5 丹酚酸B对MCAO大鼠脑组织VEGF和VEGFR2表达的影响Fig.5 Effect of Salvianolic B on expression of VEGF and VEGFR2 in MCAO ratsNote：*.P<0.01 vs Ctrl group,#.P<0.01 vs MCAO group.

3 讨论

缺血性脑卒中占中风患者的绝大部分。脑组织缺血后，供氧中断，导致神经细胞出现能量耗竭、乳酸堆积、内稳态遭破坏、神经递质异常、兴奋氨基酸毒性，再灌注产生大量氧自由基，常导致缺血脑组织的进一步损伤[11]。大量研究显示，丹酚酸B对机体损伤部位具有保护作用。如Gu等[12]研究显示，丹酚酸B通过调节ERK/P38/核因子样蛋白2(Nuclear factor-like 2 protein，Nrf2)信号通路，减轻大鼠蜘蛛网膜下出血引起的早期脑组织损伤。Ma等[13]研究发现，丹酚酸B通过对PI3K/AKT信号通路的调控，抑制氧化反应和炎症反应，降低肾缺血再灌注诱导的损伤。本文研究结果显示，丹酚酸B能缓解局灶性脑缺血再灌注诱导的脑组织病变。

当机体遭受慢性损伤或应激时，机体可以启动一系列的防御机制从而产生保护作用。细胞凋亡是机体维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。脑缺血再灌注引起的兴奋性氨基酸毒性、一氧化氮和乳酸堆积等过程都能加快细胞正常死亡的进程[14]。大量研究表明，丹酚酸B能抑制细胞凋亡。如Tao等[15]研究发现，丹酚酸B通过调节Bcl-2的表达和线粒体膜电位，抑制高糖诱导的大鼠胰岛素细胞INS-1自噬。Chen等[16]研究发现，丹酚酸B通过转化受体电位阳离子通道亚家族C成员3(Transient receptor potential cation channel,TRPC3)和TRPC6介导的钙离子过载，抑制阿霉素诱导的内质网应激和心肌细胞自噬。本研究结果显示，丹酚酸B抑制局灶性脑缺血再灌注诱导的脑组织细胞凋亡。

当机体受多种内外因刺激时，产生大量自由基，使氧化系统和抗氧化系统失衡，造成组织损伤。脑缺血再灌注后，降低氧化应激反应对脑组织具有保护作用[17]。SOD、MDA和LDH是常见的氧化应激水平的检测指标[18]。Chen等[19]研究发现，丹酚酸B通过抑制氧化应激反应，调节P53和Caspase-3信号通路，缓解氧化带密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡。另外一研究发现，丹酚酸B通过调节Nrf2抑制多氯联苯诱导的氧化应激，使SOD和谷胱甘肽的含量上升[20]。与前人研究一致，本研究结果表明，丹酚酸B能抑制局灶性脑缺血再灌注诱导的氧化应激。

ICAM-1是一种定位于内皮细胞和免疫细胞表面的糖蛋白，在稳定细胞间的相互作用和促进白细胞内皮细胞的迁移过程中发挥重要的作用[21]。正常情况下，ICAM-1低表达，当受到细胞因子如IL-1、TNF的刺激后表达量急剧增高。激活的ICAM-1与配体结合后，通过级联许多激酶，促进炎症反应的发生[22]。研究证实，ICAM-1与蜘蛛网膜下出血患者二级症状相关，抑制ICAM-1会明显改善这些症状[23]。如Xu等[24]研究显示，丹酚酸B通过降低ICAM的表达，进而抑制血小板活化和神经炎症反应，对脑缺血再灌注大鼠的脑组织神经具有保护作用。本研究结果显示，丹酚酸B能显著降低局灶性脑缺血再灌注诱导的大鼠脑组织ICAM-1的高表达，抑制炎症反应的发生。

VEGF与其受体分子VEGFR能提高血管通透性，增加细胞外基质变性，促进血管内皮细胞增殖迁移，促进血管的生成。在胚胎发生、骨骼生长、新血管生成、损伤后新生管生长以及绕过阻塞血管的新血管形成等过程都与VEGF相关[25]。本研究结果表明，丹酚酸B诱导局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织血管的新生。

P38蛋白激酶参与细胞增殖、分化和细胞凋亡的调控。P38激活后，通过调节下游蛋白的激活与表达，参与炎症反应的调控[26]。Hsp27是热休克蛋白家族的成员之一，受P38调控能抑制Caspase和NF-κB的活化，产生抗氧化应激作用，进而减轻组织受到的损害[18,27]。在多种应激反应下，Hsp27可以高表达。Zeng等[28]研究发现，丹酚酸B通过调节p38介导的活性氧生成，抑制骨肉瘤细胞增殖和细胞自噬。Tang等[29]研究显示，通过调节p38 MAPK/激活转录因子2(Activating transcription factor 2，ATF-2)信号通路，丹酚酸B保护人体内皮细胞免受氧化应激功能缺失的影响。

综上所述，丹酚酸B能诱导局灶性缺血再灌注大鼠脑组织血管的新生，缓解氧化应激对脑组织的损伤。本研究下一步计划将探讨丹酚酸B对离体神经细胞凋亡的影响及相关机制。