双氯芬酸钠大鼠在体肠吸收的研究

石英杰 王锐利 张丽锋 任国莲 张淑秋*

（山西医科大学药学院临床药学教研室，山西 太原 030001）

双氯芬酸钠（diclofenac sodium，DS）为邻氨基苯甲酸衍生物[1]，在临床上用于缓解急慢性关节炎、急慢性强直性脊柱炎、肩周炎、滑囊炎、急性的轻、中度疼痛及各种原因引起的发热等。该药在体内的半衰期短[2]（t1/2约1.5 h），血药浓度低，须频繁给药，因此研究和开发其缓释制剂更符合临床治疗的要求。

在进行药物处方研究时，可以药物肠道吸收特征为指导。本文采用在体单灌流法研究双氯芬酸钠的肠吸收动力学特征，阐述其可能的吸收机制，以期为药物的处方设计提供生物药剂学依据。

1 材 料

试剂：双氯芬酸钠（宁波斯迈克制药有限公司、批号：DOSR-1504015）；乌来糖（批号1203147，上海展云化工有限公司）；乙腈、甲醇（天津市科盟化工工贸有限公司、色谱纯）；其他试剂均为分析纯。

仪器：Agilent1200 高效液相色谱系统（美国安捷伦公司），FA1104N 电子天平，HH-2数显恒温水浴锅（上海浦东物理光学仪器厂），HL-2S恒流泵（上海嘉鹏科技有限公司）。

动物：健康雄性Wistar大鼠，重量（230±20）g（山西医科大学实验动物中心提供）。

灌流液：Krebs-Ringer 试剂：称取NaCl 7.8 g、NaHCO31.37 g、KCl 0.35 g、NaH2PO40.32 g、CaCl20.37 g，MgCl20.02 g、葡萄糖1.48g加蒸馏水至1000 mL，调节pH至7.4。

2 方法与结果

2.1 灌流液中药物的方法学考察

2.1.1 色谱条件：色谱柱：Aglient HC-C8（4.6 mm×250 mm，5 L），流动相：乙腈-0.4%乙酸铵溶液-三乙胺（45∶55∶0.2），流速：0.7 mL/min，检测波长：275 nm，柱温：30 ℃，进样量：20 L。tR为6.9 min。

2.1.2 专属性考察：用新配制的Krebs-Ringer液对小肠灌流。按“2.1.1”项下色谱条件操作，考察方法专属性，结果见图1，表明双氯芬酸钠在该方法下专属性较好。

图1 肠灌流液的色谱图：A-空白灌流液；B-含药灌流液；1-双氯芬酸钠

2.1.3 线性关系实验：精密称取约10 mg双氯芬酸钠用100 mL空白灌流液定容，配制成质量溶度为100 g/mL的溶液，分别移取该溶液适量于10 mL的容量瓶中，配制成质量浓度为1、5、10、15、25 g/mL的系列标准溶液，进样量为20 L，记录双氯芬酸钠峰面积，绘制标准曲线，得方程：A=68.021C+20.41（R2=0.9998，n=5）。结果表明：双氯芬酸钠在1～25 g/mL的范围内，有较好的线性关系。

2.1.4 方法的精密度试验：用空白灌流液分别配制质量浓度为5、10、15 g/mL的双氯芬酸钠溶液，3种质量浓度的溶液分别在1 d内重复进样6次得日内精密度，3种溶液每天进样1次，连续进样3 d得日间精密度，低（5 g/mL）、中（10 g/mL）、高（15 g/mL）3个质量浓度的日内精密度RSD分别为0.13%、0.06%、0.09%，日间精密度RSD分别为0.84%、0.61%、0.75%。可说明该方法精密度良好。

2.1.5 准确度试验：用配制好的质量浓度为5、10、15 g/mL的双氯芬酸钠溶液，以“2.1.1”项下条件操作，记录峰面积，求得双氯芬酸钠的回收率；结果表明双氯芬酸钠在上述低、中、高3种质量浓度下回收率结果分别为（100.67±1.62）%、（99.0±1.71）%、（99.51±0.60）%，结果表明该测定方法准确。

2.1.6 药物的稳定性试验：用Krebs-Ringer液对各肠段灌流，收集流出液，以此流出液配制含药浓度为10 g/mL的溶液，置于37 ℃的水浴中，每30 min取样1次，共取样6次，持续180 min，求得双氯芬酸钠的浓度，计算其相对标准偏差（RSD），RSD≤2%，表明双氯芬酸钠在灌流液中至少可以稳定3 h。

2.2 大鼠在体肠吸收实验[3-5]：将实验前禁食12 h、体质量约250 g的大鼠用0.2 g/mL的乌拉坦进行腹腔注射麻醉（0.8 g/kg），并固定于手术板上。沿腹中线剪开大鼠腹腔（约3 cm），胆总管插管引流胆汁，找出待考察肠段，在该肠段的上下两端各切一小口，插入直径约为0.3 cm的玻璃管，用手术线扎紧，用预热至37 ℃的生理盐水将小肠内容物冲洗干净。用浸有生理盐水的纱布将伤口覆盖保湿（实验过程中不停的滴加预热置37 ℃的生理盐水），用红外灯照射为大鼠取暖，以维持大鼠体温。

将含药 K-R液，预热至37 ℃，以1 mL/min灌流肠段20 min，然后将流速降至0.2 mL/min，并以此流速维持30 min使吸收达到平稳，输入端用装有含药K-R液的EP管（质量已称）灌入，输出端用空EP管（质量已称）接收，每间隔15 min迅速替换掉供药的EP管和收集的EP管，并称重，计算供药EP管与收集EP管各自的质量差值，于计时后2 h停止采集灌流液，共收集7~8个点，灌流结束后将大鼠处死，将灌流的肠段取出，冲洗干净后剪开，置于坐标纸上，测量其长度和内径。

实验考察的大鼠肠段的选择如下；十二指肠段自幽门1 cm处开始，空肠段自幽门15 cm处开始，回肠段自盲肠上行20 cm处开始，结肠段紧邻盲肠至直肠，各待测肠段截取长度约为10 cm。

2.3 数据处理：采用重量法[6-7]按以下公式计算药物吸收速率常数（Ka）和表观吸收系数（Papp）：

Qin和Qout分别为灌入液和收集液的体积（mL，根据测得质量按密度为1折算成体积）；Cin和Cout分别为肠道输入端和输出端灌流液中药物的质量浓度（μg/mL）；r为待考察肠段的内径半径；l为待考察肠段的长度； Q为灌流体积流量；V （mL，V=πr2l ）为灌流肠段的体积。

实验结果采用SPSS16.0软件进行方差分析（ANOVA），其中组间差异经SNK-q检验分析，结果以（-x±s）表示，判据为当P<0.05时结果具有显著性差异，当P>0.05时结果没有显著性差异。

2.4 结果

2.4.1 双氯芬酸钠以不同质量浓度灌流小肠考察肠的吸收动力学：分别用不同质量浓度的双氯芬酸钠灌流液对大鼠小肠进行灌流，比较双氯芬酸钠供试液在不同浓度条件下的Ka和Papp值，结果见表1。经SNK-q检验分析可知，双氯芬酸钠在实验浓度范围内的小肠吸收参数Ka和Papp差异均无统计学意义（P＞0.05）。双氯芬酸在5~20 g/mL浓度范围内的小肠吸收无浓度依赖性，说明主要以被动扩散机制吸收进入体循环。

表1 不同浓度的双氯芬酸钠的吸收参数（n = 5，±s）

表1 不同浓度的双氯芬酸钠的吸收参数（n = 5，±s）

C(g/mL) Ka(10-2/min) Papp(10-3/cm/min)5 4.56±0.18 6.36±0.011 10 4.32±0.15 6.20±0.072 20 4.76±0.21 6.92±0.092

2.4.2 双氯芬酸钠以同一质量浓度灌流大鼠不同肠段考察肠的吸收动力学：灌流液的质量浓度为10 g/mL，待测肠段的选择如“2.2项下”所述，以同一质量浓度灌流不同肠段，比较不同肠段的Ka和Papp值。结果见表2，经SNK-q检验分析可知，除回肠的Ka、Papp值与十二指肠、空肠和结肠之间存在显著性差异（P<0.05）外，其他各组之间比较均没有显著性差异。表明药物吸收最快的部位是回肠，其次是空肠、结肠、十二指肠。不同肠段的吸收趋势为：回肠＞空肠＞结肠≈十二指肠。Papp值均＞1.2 ×10-3cm/s1，表明双氯芬酸钠在小肠全段的吸收均较好[8-9]。

表2 双氯芬酸钠在不同肠段的吸收参数（n = 5，±s）

表2 双氯芬酸钠在不同肠段的吸收参数（n = 5，±s）

注：与回肠组比较，1)P<0.05

Intestine Ka(10-2/min) Papp(10-3/cm/min)Duodenum 5.28±0.681) 2.86±0.331)Jejunum 6.42±0.951) 6.34±0.32 Ileum 8.47±0.69 6.73±0.27 Colon 5.89±0.511) 5.40±0.571)

2.4.3 双氯芬酸钠以不同灌流体积流量灌流小肠考察肠的吸收动力学：以同一质量浓度的含药灌流液（10 g/mL），以不同的灌流速度（0.2、0.4、0.8 mL/min）对大鼠小肠进行灌流。比较不同灌流速度下药物的Ka和Papp值。见表3，结果表明：经SNK-q检验分析可知，在各体积流量下的Ka和Papp比较差异均显著（P＜0.05），利用灌流体积流量的改变来模拟小肠不同的运动状态，本实验说明小肠在不同的运动状态下对双氯芬酸钠的吸收产生一定的影响。

表3 双氯芬酸钠在不同体积流量下的吸收参数（n = 5，±s）

表3 双氯芬酸钠在不同体积流量下的吸收参数（n = 5，±s）

注：与体积流量（0.2 mL/min）组相比较，1)P<0.05；与体积流量（0.4 mL/min）组相比较，2)P<0.05

perfusion(mL/min) Ka(10-2/min) Papp(10-3/cm/min)0.2 4.32±0.152) 6.20±0.0722)0.4 5.88±0.141) 8.56±0.0741)0.8 6.92±0.181)2) 9.22±0.0581)

3 讨 论

3.1 用于评价药物肠道吸收情况的动物模型有很多，目前常用的方法主要有“在体循环法”和“单向灌流法”。在体循环法中较高的灌流速度，可引起肠黏膜的脱落，造成损伤，而较长的灌流时间，会影响药物的代谢，更有可能导致一些药物的降解，现已较少应用。相比之下，单向灌流法灌流速度低（约0.2 mL/min），灌流时间短，并且与给药后药物接触肠道的环境较为接近。因此为提高实验测定的准确度。本实验采用了“单向灌流法”评价双氯芬酸钠在肠道的吸收情况。

3.2 大鼠在体肠吸收实验过程中肠道对水分的吸收或分泌会对实验测定产生一定的影响，因此需要校正灌流液的体积，以保证实验结果的准确性。目前多采用的方法有酚红法与重量法，然而在灌流过程中酚红可能会被肠道吸收，并且还可能影响肠道的吸收环境。因此本实验引入重量法进行灌流液的体积校正，本法操作简单，并且可以较真实客观地反映肠道水分吸收情况。

3.3 由于大鼠的生理结构中的输胆总管开口于十二指肠的上端，分泌的胆汁直接进入十二指肠。胆汁的成分很复杂，其中的有机成分胆盐、胆固醇和卵磷脂具有乳化剂的作用，可影响一些药物的代谢[10]。同时进入十二指肠内的胆汁可通过肠肝循环影响肠道中的药物浓度。因此为排除胆汁因素对药物测定的影响，本实验将胆汁引流，以确保实验结果的准确性。

3.4 一般认为大鼠小肠全肠段的Papp＜1.8×10-4cm/min，或Papp＞1.2×10-3cm/min时，表明药物难吸收或完全吸收。本实验结果双氯芬酸钠的有效渗透吸收顺序为：空肠≈回肠＞结肠＞十二指肠。根据以上标准，说明双氯芬酸钠在大鼠各肠段均有较好吸收，适于制备成缓释给药系统。