miRNAs用于恶性胸腔积液鉴别诊断的研究进展

朱苗骏 张美玲 张新 谭若颖

摘 要 胸腔积液是指胸膜腔内液体过量积聚，临床上可分为漏出液和渗出液两类，其中漏出液的病因主要为心力衰竭和肝硬化等，渗出液的病因则复杂多样，治疗方法也各异。恶性胸腔积液属渗出液，对其的鉴别诊断在临床上十分重要。近年来，随着分子生物学及其相关技术的快速发展，各种生物标志物被陆续发现并被用于各种疾病的临床诊断。本文概要介绍miRNAs用于恶性胸腔积液鉴别诊断的研究进展。

关键词 恶性胸腔积液 miRNAs 肺癌 诊断

中图分类号：R730.43； R561.3 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）11-0050-04

Research progress in the differential diagnosis of miRNAs for malignant pleural effusion

ZHU Miaojun1*， ZHANG Meiling2， ZHANG Xin2， TAN Ruoying1**[1. Shanghai Biovue Technology （China） Co.， Ltd.， Shanghai 200031， China； 2. Department of Respiration， Zhongshan Hospital， Fudan University， Shanghai 200032， China]

ABSTRACT Pleural effusion occurs when fluid accumulates in the pleural space and can be clinically divided into a transudate or an exudate， in which the causes of transudate are mainly ascribed to heart failure and cirrhosis and so on， while the cause of exudate is complex and diverse and the methods for its treatment vary. Malignant pleural effusion is an exudate and its differential diagnosis is very important in clinic. In recent years， various biomarkers have been found and applied in clinical diagnosis with the development of molecular biology. In this review， we focused mainly on the progress of miRNAs for the differential diagnosis of malignant pleural effusion.

KEY WORDS malignant pleural effusion； miRNAs； lung cancer； diagnosis

胸腔积液又称胸水，是临床上常见的内科疾病症状之一，肺、胸膜和肺外疾病均可引起[1-2]。对胸腔积液患者，判别胸腔积液的性质和明确病因非常重要，能否及早、正确地明确病因将直接影响到治疗方案的拟定、治疗效果和患者预后。

1 胸腔积液的分类和鉴别诊断

胸腔积液常作为一种并发症出现，可继发于各种良、恶性疾病。临床上将胸腔积液分为漏出液和渗出液两类，两者可通过传统的胸腔积液检查方法如Light标准、血清-胸腔积液白蛋白梯度、胆固醇浓度、血清氨基末端脑钠尿肽前体水平等方法予以区分。

胸腔积液还可按其性质不同分为良性胸腔积液（benign pleural effusion， BPE）和恶性胸腔积液（malignant pleural effusion， MPE）两類[1]。BPE的病因主要包括充血性心力衰竭、心包疾病、肝硬化失代偿期、肾病综合征、结核性胸膜炎、类肺炎性胸腔积液和肺栓塞等。MPE多由原发于胸膜的肿瘤或其他恶性肿瘤引起，约占所有胸腔积液的50%[3]。几乎所有的恶性肿瘤都有累及胸膜的可能，但MPE的最常见病因是肺癌，约占所有MPE病因的1/3。约有15%的肺癌患者在确诊时即合并有MPE，约有50%的肺癌患者会在终末期出现MPE[4]。肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤类型，其中非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer， NSCLC）约占所有肺癌的90%以上。大多数NSCLC患者在被诊出时疾病已至晚期，而MPE是晚期NSCLC的并发症之一。MPE在肺腺癌患者中尤为常见，约40%的肺腺癌患者合并有MPE。这是因为肺腺癌多为周围性肺癌，后者易累及胸膜，进而产生MPE[1]。乳腺癌的发病率很高。MPE的第二常见病因就是乳腺癌，约占MPE病因的1/5。淋巴瘤、卵巢癌和胃癌也是MPE的主要病因。此外，还有5% ～ 10%的MPE的病因不明[1]。

胸腔积液的性质不同，治疗方案和患者预后也不同，所以胸腔积液的良、恶性鉴别诊断至关重要。目前，MPE诊断主要依赖于对胸腔穿刺获取的胸腔积液的细胞学分析。然而，即使是有经验的病理学医师和进行多次穿刺检查，胸腔积液细胞学分析对MPE诊断的灵敏度也只有50% ～ 70%[5]。虽然进行胸腔镜胸膜活检的MPE诊断灵敏度可达90%以上[6]，但该方法属侵袭性操作，且存在感染、出血和慢性疼痛等并发症风险，不适用于身体状况差且伴有其他合并症的患者。因此，2010年更新的英国胸科学会胸腔积液诊治指南[2]仍十分强调胸腔积液检查在MPE诊断中的作用。对晚期NSCLC合并胸腔积液患者，由于患者已无法接受手术治疗，加之胸腔积液样本较活组织样本更易获得，胸腔积液检查的地位更加重要。

随着分子生物学及生物技术的发展，人们已发现许多具有诊断价值的生物标志物，包括肿瘤标志物如癌胚抗原，癌抗原CA153、CA199、CA125，以及细胞角蛋白片段CYFRA 21-1等，但它们用于MPE诊断的灵敏度均不高[7-9]。

胸腔积液的良、恶性鉴别诊断现依然是临床上的一大难题，尤其是对那些肿瘤合并心力衰竭、肿瘤继发的阻塞性肺炎或肺不张、肿瘤侵犯淋巴管或纵隔淋巴结所致淋巴回流障碍等引起的胸腔积液更难区分其良、恶性质。另外，胸腔积液的细胞成分相对比较复杂，其中混杂有间皮细胞、巨核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和恶性肿瘤细胞等。创伤、炎症和肿瘤等都能导致间皮细胞的过度增殖，且有时细胞过度增殖的程度介于良、恶性之间，细胞学检查很难区分胸腔积液的性质。临床上对新的准确、有效和无创的良、恶性胸腔积液鉴别诊断方法的需求十分迫切。

2 miRNAs用于胸腔积液鉴别诊断的研究进展

已知非编码RNAs通过多种调控方式参与着众多生物学过程，其中以对miRNAs与恶性肿瘤发生、发展关系的研究最多。miRNAs是一类长度为19 ～ 24个核苷酸的内源性、高度保守的单链非编码RNAs分子，能够通过mRNA剪切和翻译抑制等方式调控靶基因的表达[10]。miRNAs不仅可在组织中稳定表达并发挥作用，且也可在外周循环血及其他体液中稳定存在，并已作为特异性标志物用于多种恶性肿瘤的诊断和分型[11-12]。有关miRNAs能在体液中稳定存在的机制目前主要有两种观点：一种观点认为，分泌到胞外的miRNAs是存在于微囊泡（exosomes）中的，由于有微囊泡的保护，得以避免被酶降解[13]；另一种观点认为，游离miRNAs在体液中以蛋白复合体的形态存在，只有经蛋白酶作用后才会被核酸酶降解[14]。鉴于循环miRNAs可在外周体液中稳定存在，故通过检测外周体液中miRNAs的水平变化，便能用于一些疾病的鉴别、诊断和分型。作为一种新型微创体液检查方式，miRNAs水平检测具有简便、迅捷等特点，还可用于实时监测疾病进展和治疗效果。

2.1 胞外游离miRNAs用于胸腔积液鉴别诊断的研究进展

近十年来，有关胞外游离miRNAs水平检测用于良、恶性胸腔积液诊断的研究很多。Xie等[15]的研究发现，与BPE相比，MPE中miR-30d、miR-24和miR-26a的表达水平更高；而在MPE中，与肿瘤对化疗敏感相比，肿瘤对紫杉醇耐药时的miR-152水平较低，提示miR-152水平具有用作肿瘤药敏性标志物的潜力。Shin等[16]的研究则揭示，与BPE相比，肺腺癌来源MPE中miR-134、miR-185和miR-22的表达水平较低。鉴于这些miRNAs均已被证实是肿瘤抑制因子[17-18]，故联合应用这些miRNAs和癌胚抗原水平检测可大大提高肺腺癌来源MPE诊断的灵敏度（达92%）和特异性（达92.5%）[16]。

Wang等[19]的研究发现，MPE中的一种miRNAs“指纹图谱”（miR-100高表达以及miR-134、miR-345、miR-151和miR-93低表达）与NSCLC患者的低生存率有关，可用作NSCLC患者不良预后的独立影响因子。Qian等[20]的研究揭示，miR-93可经负调节血管生成素-2的表达而干扰上皮细胞的迁移、侵袭和增殖，从而影响肿瘤的血管和淋巴管生成，进而抑制MPE生成。该研究还发现，与预后差、疾病无进展生存期短的MPE患者相比，预后良好的MPE患者MPE中的miR-93表达量明显更高。Han等[21]的研究发现，与BPE相比，肺腺癌来源MPE中的miR-198表达量大大降低；联合应用miR-198和癌胚抗原水平检测能较单用CYFRA 21-1水平检测更有效地区分肺腺癌来源的MPE和BPE，灵敏度和特异性分别达89.2%和85.0%。

2.2 胞外微囊泡miRNAs用于胸腔积液鉴别诊断的研究进展

近年来，有关胞外微囊泡miRNAs的研究也越来越多。Lin等[22]的研究发现，与肺炎和肺癌患者相比，肺结核患者胸腔积液中的miR-378i表达量明显更高，而miR-205-5p和miR-200b的表达量在肺癌患者胸腔积液中明显升高。Wang等[23]的研究发现，微囊泡miRNAs在肺腺癌来源胸腔积液、肺结核来源胸腔积液和BPE中的表达谱不尽相同，其中9种微囊泡miRNAs（miR-205-5p、miR-483-5p、miR-375、miR-200c-3p、miR-429、miR-200b-3p、miR-200a-3p、miR-203a-3p和miR-141-3p）在肺腺癌来源胸腔积液中的表达量明显更高，3种微囊泡miRNAs（miR-148a-3p、miR-451a和miR-150-5p）在肺结核来源胸腔积液和BPE中的表达量差异较大，提示可据此区分肺结核来源胸腔积液和BPE。另有研究显示，miR-200家族与肺癌的发生、发展及其上皮细胞-间充質转化机制密切相关[24-25]，提示miR-200家族可能与MPE生成有重要关联。

3 miRNAs用于胸腔积液鉴别诊断的研究方向

miRNAs用作诊断生物标志物具有很多优点，尤其是在恶性肿瘤的诊断中，相较其他诊断标志物，灵敏度和特异性均更高，具体优点包括：①miRNAs在多种体液中稳定存在，易获得，易存储；②研究表明，miRNAs的表达不仅具有一定的肿瘤特异性，而且还与肿瘤的某些生物学特性相关；③miRNAs能被精确、经济（约10美元）和快速（约3.5 h）地检测[目前主要有3种检测方法，即miRNAs芯片、荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）和深度测序技术]。miRNAs用作诊断生物标志物的难点主要在于许多miRNAs的特异性现还难以判别，亟待更多、更深入的研究的揭示。

上海翔瓊生物技术有限公司与复旦大学附属中山医院呼吸科合作，开展了miRNAs用于MPE诊断和预后的技术研究，应用荧光定量PCR法对MPE和BPE患者胸腔积液中的miRNAs进行大范围的检测（共计1 920种miRNAs），并筛选出与MPE相关的96种miRNAs阵列，通过样本测试和数据分析等，建立了支持向量机数学模型。目前，不仅筛选出可用于辅助MPE诊断的由10种miRNAs组成的miRNAs“指纹图谱”，还发现一种miRNAs组合能很好地区分肺癌来源和肺腺癌来源的胸腔积液，且诊断的准确性均达90%以上。由于国家对生物医药产业创新发展的高度重视与大力支持，基于miRNAs检测的肿瘤筛查和诊断技术已在我国得到很好的发展并取得良好的实效。例如，miR-92a检测试剂盒（荧光定量PCR法）已于2018年3月获得国家食品药品监督管理总局的批准注册，用于辅助大肠癌诊断。相信在不久的将来，miRNAs检测将会更广泛地用于肿瘤筛查和诊断。

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