李 佳 刘忠义U - 付 满 刘红艳U - 吴小艳 - 李 汀
(1. 广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室〔北部湾大学〕,广西 钦州 535000; 2. 湘潭大学化工学院,湖南 湘潭 411105)
发酵肉制品在发酵及成熟过程中,由于微生物的发酵作用,使得蛋白质、糖类和脂肪降解,产生多种挥发性成分如烷烃类、醇类、醛类、酮类、酯类、酚类等化合物[1-2][3]2,39-40。这些风味物质的存在很可能决定了产品的感官风格,是评价香肠品质的重要指标。
顶空(HS)—固相微萃取(SPME)技术是提取样品挥发性风味物质的处理技术,具有快速简便、无需溶剂萃取以及使用条件温和的优点[2,4],可直接与气相—质谱连接鉴定挥发性风味组分。目前,SPME处理技术已广泛应用于发酵肉制品[2][3]3-5、香精香料以及其他各类食品中挥发性化合物成分的分析[4-6]。
传统的发酵肉制品一般在低温环境经过长时间的发酵和干燥,风味独特[2][3]5,12,25,但是生产加工周期很长,菌相复杂,且成本高昂。因此,非常有必要接种人工菌种,改进加工工艺,提高发酵肉制品的食用安全性,缩短发酵生产时间。有试验表明,在32 ℃的温度下,添加人工发酵剂发酵6~9 h可以获得高食用安全品质的发酵香肠[7];在添加人工发酵剂,大幅度缩短发酵生产时间,低于30 g/kg食盐添加量的条件下,也能很好保障产品的食用安全性[8]。
尽管已有不少关于传统发酵肉制品或者半发酵肉制品的相关风味研究[1-2][3]2-5,但是基本上是以成品为研究对象,而发酵时间与肉制品风味的关系研究较少见,尤其是基本未见接种纯培养物短时间发酵即完成发酵的发酵肉制品的风味研究。本研究拟采用SPME技术并结合气相-质谱(GC-MS)对32 ℃发酵6 h及9 h香肠的挥发性成分进行分析和鉴定,并对2种香肠的风味品质与质量做进一步的比较和判断,以期为发酵香肠的技术应用提供依据。
1.1.1 材料
新鲜猪肉:湘潭大学购物中心;
乳酸菌发酵剂:3.12×109CFU/g,北京川秀科技有限公司;
酵母发酵剂:3.95×109CFU/g,安琪酵母股份有限公司;
肠衣:谭氏百盛电子商务有限公司;
五香粉、姜粉:食品级,上海味好美食品有限公司;
红曲粉:食品级,上海佳杰天然食品色素有限公司;
磷酸盐:食品级,市售;
白糖:食品级,广州福正东海食品有限公司。
1.1.2 主要仪器设备
气相色谱—质谱联用仪:GCMS-QP2010Plus型,美国安捷伦公司;
电子分析天平:PTX-FA-110型,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
1.2.1 发酵香肠的制备 参照文献[8]。
(1) 香肠配方(质量分数,以肉总量百分比计):2.0%食盐,0.2%味精,0.3%胡椒粉,0.2%姜粉,0.2%五香粉,2.4%白糖,0.1%红曲粉,0.1%磷酸盐,0.8%酱油,2.4%黄酒。
(2) 制备方法:瘦肉加入准备好的腌制剂在2 ℃冷藏柜腌制18 h;然后肥、瘦肉按照5∶3的比例混合,加入质量分数0.08%(以肉总量百分比计)乳酸菌和0.04%酵母后灌肠,将其置于(32±1) ℃、相对湿度75%~80%下发酵6 h或者9 h;然后在(70±1) ℃的恒温箱中干燥2 h。
1.2.1 GC-MS分析样品的制备 分别将发酵6,9 h的香肠绞碎,称取一定量的样品置于萃取瓶内,密封后将SPME(50 μm PDMS)针管穿透萃取瓶隔垫,插入瓶内,推动手柄使萃取头伸入样品上部完成顶空吸附过程,应保证萃取纤维头不要触碰到样品,且每次试验萃取头与样品距离一致,在规定条件下恒温水浴加热,萃取完毕迅速插入GC进样口,解析5 min后,取出SPME手柄及萃取头。
1.2.2 色谱条件 毛细管柱(DB-5,60 m×0.25 mm,0.25 μm);柱温 40 ℃保持 5 min,再以20 ℃/min程序升温到120 ℃,而后以5 ℃/min程序升温到190 ℃,之后以0.5 ℃/min程序升温到198 ℃,最后以5 ℃/min程序升温到250 ℃,保持5 min。进样口温度250 ℃;载气(He)流量1 mL/min;解析温度250 ℃;不分流模式进样。
传输线温度280 ℃;四级杆温度150 ℃;离子源温度230 ℃;扫描范围m/z33~450;电离电压70 eV。
1.2.3 SPME萃取条件单因素试验 参照文献[2,9],在确定解析时间为5 min的前提下研究取样量(2.5,3.0,3.5,4.0,4.5 g 5个梯度,萃取时间50 min,萃取温度60 ℃)、萃取时间(35,40,45,50,55 min 5个梯度,样品量3.0 g,萃取温度60 ℃)、萃取温度(50,55,60,65,70 ℃ 5个梯度,选取样品量3.0 g,萃取时间50 min)3个因素对萃取效果的影响。将总峰面积设为主要考察指标,有效出峰数(相对峰面积≥0.1%)设为辅助指标。
1.2.4 发酵香肠样品的分析 按照前述单因素试验得出的最佳萃取条件分别对32 ℃发酵6 h和9 h 2种香肠样品挥发性物质进行萃取后,直接在GC-MS上机分析。
1.2.5 数据处理 所有试验重复3次。用SPSS statistix 16.0统计分析软件进行均值计算及方差分析,数值以(均值±标准差)表示,P<0.05即表示差异显著。作图采用Origin 8.5。
受样品的挥发性化合物种类、萃取瓶的容量等因素的影响,样品的质量会影响萃取效果。如图1所示,样品量从2.5~3.0 g时,随着样品质量的提高,出峰面积和数量随之增加;此后,当样品质量进一步增加时,出峰面积和数量随之下降。萃取涂层对萃取品种挥发性风味物质的吸附量与其在瓶内的浓度有关[2,9],当萃取品内挥发性化合物浓度较低时,增加其浓度能增加其萃取量。然而,固相微萃取头的吸附量与萃取瓶的有效空间有关[2,9],当样品质量达到3.0 g以上时,样品占了瓶内较大的空间,挤占了萃取瓶的有效空间,导致出峰面积反而降低,且此时相对面积占优势的峰所对应的物质相对浓度更高,会影响相对浓度低的物质的吸附,因此,出峰数量会同时减小。
图1 样品质量对萃取效果的影响
如图2所示,随着萃取时间的延长,出峰面积和数量在35~50 min范围内呈增加趋势,萃取时间为50 min时,峰面积达到最大值。而当萃取时间增加到55 min时,峰面积略有上升,但出峰数量略有减少。由于挥发性物质在萃取头、顶空相、介质相存在扩散分配过程,SPME萃取纤维头需要一定的时间才能达到吸附平衡[9],因此萃取初期吸附量增加会较为迅速,随着时间的延长,萃取头上吸附的物质又逐渐解吸,长时间的萃取对萃取涂层有一定的损耗以及可能导致组分之间发生化学反应,萃取时间到55 min时,峰面积增加,但出峰数量却有所下降,可能是萃取头上部分物质的解吸,但个别挥发性较好的化合物浓度快速增加,因此出现峰面积增加但出峰数量却略有降低,故此选择50 min萃取时间为宜。
如图3所示PDMS,不同温度下具有不同的萃取效果,萃取温度在60 ℃时具有最大的峰面积和数量,在此温度上随着温度的减少和上升,峰面积均呈下降趋势,但高于此温度,峰面积下降的速率变缓。各挥发性物质在各相之间的分配及速度也受温度影响,温度升高加快了瓶内挥发性物质分子的热运动,有利于扩散,但温度进一步升高可能使风味物质之间发生热聚合反应[2]。根据试验结果,选择60 ℃萃取温度较为合适。
图3 萃取温度对萃取效果的影响
2.4.1 发酵香肠中检出的挥发性成分 发酵香肠的挥发性物质的总离子流图见图4,风味成分种类与其相对含量见表1。
图4 发酵香肠的挥发性化合物总离子图
2.4.2 2种香肠中挥发性成分的差别 如表1和表2所示,发酵6 h的香肠中相对含量最多的是酯类物质,其后依次是醇类、酸类、醛类、烷烃、酮类,而发酵9 h香肠中相对含量最多的为醇类(主要是乙醇)、其次为酮类、酯类、烷烃类、酸类、醛类。
发酵6 h的发酵香肠中鉴定出的挥发性风味成分有54种,主要包括烷烃类物质5种,醛类2种、酯类19种,酮类4种、醇类9种、酸类4种、以及相对峰面积合计达43.39%的11种其他类别的化合物(包括胺类、萜烯类、含硫化合物、苯酚类及醚类物质),在发酵香肠中,脂环化合物具有浓郁的肉香味[10-12];其次是酯类物质,共19种,占总挥发性风味含量18.90%。酯类可能来源于脂质、蛋白质分解氧化反应及其 Strecker 降解和 Maillard反应[13],此外也可能源自乳酸菌和酵母菌的发酵。含硫化合物2-苯胺基苯硫酚可能是硫胺素降解或者一些含硫氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、胱氨酸产生[14],其阈值较低但含量不高。
与发酵6 h相比,发酵9 h的发酵香肠中的香气成分存在明显的差别,测定出的挥发性风味成分种类数目大幅减少,共20种,其中,相较发酵6 h的香肠而言,酯类香气成分种类数大幅减少,从发酵6 h时的18种减至2种,仅为总含量的4.52%;醇类物质含量发酵到9 h,其种类数从9种降到了4种,相对含量却增加到了74.37%。醇类物质的相对含量增加主要是由于酵母的发酵导致乙醇含量大幅增加,而种类数的减少则可能由于发生酯化反应或氧化反应[15],导致其他醇类相对含量降低,在分析过程中被其他物质所掩盖而未被检测到。相对含量过高的乙醇还可能是导致发酵9 h香肠中挥发性物质被检出种类大幅减少的关键原因。
表1 2种香肠的主要挥发性风味物质及其相对含量
表2 两种香肠中挥发性风味物质的差别
(1) 酯类:发酵6 h的香肠中含有较为丰富的酯类物质,共计检出19种之多,与目前有关于发酵香肠的研究[10-14]差异极大,可能是由于发酵以及干燥的时间不同所导致的。本试验中发酵9 h的香肠中也只检出6-己内酯和己二酸双2-丁氧基乙酯2种脂类化合物。酯类多具有花香和水果香,对风味具有特殊的贡献。有研究[16]表明,腌制火腿的特征风味与乙酯类物质(尤其是带甲基支链的短链酯)有关。发酵6 h的香肠中己二酸二丁氧基乙酯在香肠中的相对峰面积最高,达到了4.16%。此外,在发酵6 h的香肠中,还检测出了6-己内酯、1,5-辛内酯、硬脂酸异丙内酯,其相对峰面积达到了0.65%。内酯类化合物对许多食品赋予了桃子、椰子等果香味,甚至在稀释之后还会散发出另一种水果的香味[17]。在酯类物质的种类和相对峰面积上,6 h的发酵香肠具有明显的优势。
(2) 醇类:醇类主源于糖类的微生物发酵代谢及脂肪的氧化,香肠发酵过程中产生的脂肪酶对这一过程影响显著,从而影响产品的最终风味[18-19]。发酵6 h的香肠中醇类物质的种类更为丰富,发酵9 h后的香肠则在相对峰面积上高得多,且主要是以乙醇的形式存在。醇类物质中的芳香醇也可能来自天然香辛料。发酵6 h的香肠中检出松油醇、薄荷醇和(+)-雪松醇,芳香醇类挥发性物质的阈值通常较低,即较低的含量便能表现出较强的风味特征,因此这些物质在风味构成中的作用也不容忽视;脂肪醇主要有芳樟醇(具柠檬香味,又具有浓青带甜的木青气息,似玫瑰木香气,更似刚出炉的绿茶青香,既有紫丁香、铃兰香与玫瑰的花香,又有木香、果香气息)、法尼醇和三甲基戊醇等,脂肪醇挥发性相对较弱。发酵9 h后的香肠乙醇占了70.92%,同时检出了4-庚醇及2,5-二甲基-3,4-己烷二醇(发酵6 h香肠中未检出)。大多数醇类物质阈值较高,但具有甜香味,并且对醛类、酯类物质产生是必不可少的,对香肠整体风味具有改善作用。
(3) 酸类:酸类物质对酯类物质的生成至关重要,另外,产品的风味复杂性及独有的感官风味特点也离不开酸类物质。发酵9 h的香肠的种类和数目较发酵6 h的香肠有一定的差异。两组中均检出共同成分棕榈酸和乙酸,但发酵6 h香肠中还检出肉豆蔻酸、硬脂酸,而发酵9 h 香肠中则还检出酮丙二酸。
(4)酮类和醛类:酮类物质一般由美拉德反应产生,酮类物质风味成分一般呈奶油味[20],并且阈值较低,是重要的香气成分[21]。发酵6 h和发酵9 h肠中主要挥发性风味物质3-羟基-2-丁酮,其相对峰面积分别为4.32%和6.89%,发酵6 h肠中还检测到一定的4-辛酮、4-丁基-2-氧杂卓酮、2-十九烷酮。酮类物质是醇的氧化产物或酯类分解产物,2种肠中酮类物质的差异可能与酯类物质的含量有关。
值得一提的是,醛类化合物在两种肠中种类都较少,发酵6 h的香肠中检出壬醛和枯茗醛,其相对含量为1.89%,发酵9 h香肠中仅检出相对含量为0.22%的壬醛。壬醛呈青草和生脂肪味,枯茗醛呈青草香和药草香[22]。
(5) 其他化合物:发酵6 h和9 h肠中均检出5种烃类物质,含两种共同成分。烃类化合物通常都具有高芳香阈值,对于香肠的整体风味贡献不大。
其他类型的挥发性物质主要包括胺类5种、萜烯类3种、醚类3种、苯酚类2种。
香肠中的萜烯类物质主要来源于添加的香辛料,萜烯类物质通常为强呈昧的挥发性风味物质,具有一定的香辣味,在食品调味料中有广泛的应用。在本试验的腌制过程中,添加了白胡椒粉、五香粉、姜粉等香辛料,在6 h 发酵肠中检测到了角鲨烯、8-甲基-1-癸烯和2,6-二甲基庚-1,5-二烯,其相对含量占总挥发性物质0.64%,但9 h发酵肠中并未检测到,可能与这类物质较强的挥发性有关,这与张春晖的研究结果很类似[23]。
醚类中检出的茴香脑也可能来源于添加的香料,具有八角茴香经典气味。
发酵6 h未检测出苯酚类物质,而发酵9 h检出2-苯胺基苯硫酚、4-仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚,占总挥发性风味物质0.28%,与一些发酵香肠研究不同的是,本试验中苯酚类物质含量较低,主要是由于未采用烟熏工艺,少量的苯酚可能来源于苯甲醛和苯丙氨酸在微生物作用下的分解[24]。
风味物质的鉴定离不开人体嗅觉的感官分析,但使用仪器分析来检测风味成分也非常重要[25]。试验中发现发酵6 h的香肠在口感及风味上更为浓郁香醇,其感官评价得分值达81.2分;发酵9 h的香肠的口感及风味稍差,其感官评价得分值为79分,这种口感和风味上的差异利用HS-SPME-GC-MS技术分析得到了验证。
(1) 利用单因素分析方法,分析了取样量、萃取时间、萃取温度3个因素对萃取效果的影响,优化了SPME的萃取条件,即样品质量为3.0 g、萃取时间为50 min,萃取温度为60 ℃。
(2) 在优化的萃取条件下,利用HS-SPME-GC-MS技术分析比较了发酵6 h和9 h香肠挥发性风味物质的差异。发酵6 h的发酵香肠中被鉴定出的挥发性风味成分有54种,包括烷烃类物质5种、酯类19种,酮类4种、醛类2种、醇类9种、酸类4种以及胺类、萜烯类、含硫化合物、苯酚类及醚类等其他类别的化合物11种;发酵9 h的发酵香肠中被鉴定出20种挥发性风味物质,其中烷烃类5种、酯类2种、酮类1种、醛类1种、醇类4种、酸类3种及其他类化合物4种。各香气成分中的相对含量也有明显差异性。数据显示,两种香肠挥发性成分组成差异比较大,发酵6 h香肠在风味成分的种类及成分上更具优势。
(3) 进一步的研究将针对不同益生菌菌种及不同菌种组合对发酵风味的影响,确定对特征发酵风味具有关键作用的主香成分,以及接种发酵香肠保藏过程中的风味变化。