黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco AMH基因的克隆鉴定及表达

王乐，程磊，王秋实

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

黄颡鱼Pelteobagrusfulvidraco广泛分布在我国长江、珠江和黑龙江等各大淡水域，肉质鲜美细嫩、无肌间刺，富含多种蛋白质，是一种深受消费者喜爱的淡水名优养殖对象[1,2]。黄颡鱼生长速度较为缓慢，即使是在相同的养殖环境中，雄性的生长速度也远快于雌性[3]。黄颡鱼是研究性别分化及生长调控机理的典型鱼类。

抗缪勒氏管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）也叫缪勒氏管抑制物（Müllerian inhibiting substance，MIS），是 β 转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中的一员[4]。由法国科学家Jost在1940年首次发现后，Picard等于1984年首次从初生牛犊的胚胎精巢中提取纯化获得AMH的蛋白，之后相继在各种哺乳动物中开展相关研究[5,6]。AMH是性别分化的重要调控因子，在哺乳动物的雄性性腺分化期可以抑制缪勒氏管形成，表明AMH可能对雄性个体的精巢发育有一定作用[7]；雌性个体的AMH可阻止原卵泡的形成，降低卵泡刺激素的分泌[8]，在卵巢生理中起重要调控作用[9]。早期AMH的研究主要集中在哺乳动物和鸟类中，大部分硬骨鱼没有缪勒氏管，对鱼类研究的很少。直到2002年，Miura等在日本鳗鲡Anguilla japonica中发现了一个精子诱导激素的cDNA，虽然与已获得的AMH同源性很低，但其作用模式却与哺乳动物及鸟类的AMH极为相似，功能分析验证为鱼类的AMH[10]。其特殊的表达模式在硬骨鱼性腺发育中也起重要的调控作用。本项目组测序获得了黄颡鱼的基因组数据，并在性别分化及生长调控机理的研究方面取得了一定进展[11-13]。本试验通过克隆黄颡鱼AMH基因序列，分析该基因组织表达模式，以期为黄颡鱼性别分化及生长调控机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用1、2龄黄颡鱼各30尾，购买自淡水鱼批发市场。采用活体快速解剖的方式收集脑、鳃、肾、肝、脾、性腺、肌肉及血液组织，迅速放入液氮中保存，随后转移至-80℃冰箱中，用于提取总RNA。将尾鳍样本保存在95%酒精溶液中，用于提取DNA。

1.2 RNA提取及反转录

采用TRNzol Universal试剂（天根生化公司）提取样品总RNA。取保存于-80℃的组织样品50mg和血液300μL，加入1mLTRNzol Universal试剂，置于冰上快速匀浆完全，利用氯仿-异丙醇提取法分离纯化后溶解于RNase-Free ddH2O中，DNase I（TaKaRa）纯化，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，以Nanodrop8000检测RNA纯度及浓度，RNase-Free ddH2O稀释至 50ng/μL。

本试验的反转录处理包括两种：第一种反转录获得cDNA用于AMH基因开放阅读序列的扩增。该扩增利用PrimeScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa），按说明书采用两步法完成。第一步反应采用10μL体系，总RNA的用量为1μg，反应条件为65℃，5min；第二步反应采用相应的20μL体系，反应条件为42℃处理20min，95℃处理5min，然后进行70℃，15min的失活处理。保存于-20℃。

第二种反转录产物用于Real-Time PCR实验，利用 PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa）于冰上操作，按说明书指示完成，采用10μL体系，总RNA的用量为200ng。37℃反转录反应15min，85℃酶失活处理5s，-20℃保存。

1.3 DNA提取纯化

剪取少量尾鳍，利用酚-氯仿抽提法纯化总DNA。DNA溶解于RNase-Free ddH2O中，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。以Nanodrop 8000检测DNA的纯度和浓度后，用RNase-FreeddH2O稀释到约50ng/μL备用。

1.4 AMH基因扩增

全长序列的扩增引物设计来源于NCBI中已发布的近缘物种斑点叉尾Ictalurus punctatus的AMH 序列（XM_017477698）（表 1）。扩增反应所用模板分别为总RNA经反转录所得cDNA及提取纯化的DNA。每个PCR反应体系为50μL，包含25μL的 2×Es Taq MasterMix（Dye）（康维世纪）、10μM的上下游引物各2μL和1μL的模板，用ddH2O补足至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；扩增35个循环，每个循环94℃变性30s、60℃退火60s、72℃延伸90s；72℃终延伸15min。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，用Axygen胶回收试剂盒纯化。纯化产物连接至pMD19-T载体（TaKaRa），并转化至DH5α感受态细胞（TaKaRa）。挑选阳性单克隆经PCR验证后，送至金唯智生物公司测序。

表1 本研究所用的引物信息Tab.1 Primersusedinexperiment

1.5 AMH基因序列及结构分析

使用软件BioEdit 7.0将测序所获得AMH序列信息进行拼接整理；利用Expasy的在线工具Translate（https：//web.expasy.org/translate/）预测 AMH 基因的开放阅读框及氨基酸序列；利用Expasy的在线工具 ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）计算预测该蛋白质的理论等电点和分子量信息；用在线工 具 SignalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测分析信号肽序列及半胱氨酸残基；利用软件Clustalx 1.81进行黄颡鱼AMH与其他物种AMH氨基酸间多序列比对；用cluster W软件进行多重比对黄颡鱼AMH与其他物种AMH氨基酸间同源性；利用 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/）分析蛋白结构和功能。应用MEGA4.0软件进行1 000次bootstraps值验证，构建系统发育树。

1.6 AMH基因的表达分析

以 SYBR Premix ExTaqTM（TaKaRa）操作说明为指导，使用QuantStudio 6 Flex系统（Applied Biosystems）进行Real-Time PCR反应，检测AMH基因在不同组织中的表达，Real-Time PCR的引物根据扩增产物的测序结果，在开放阅读框内设计获得。内参基因为黄颡鱼β-actin。引物合成由金唯智生物公司完成，信息如表1所示。反应体系20μL，包括SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10μL、正向引物及反向引物（10μm）各 0.4μL、ROX Reference DyeⅡ0.4mL和模板cDNA 1μL，用ddH2O补足至20μL。反应条件为标准的两步法程序：95℃预变性10s；扩增40个循环，每个循环95℃变性5s、60℃退火34s。反应结束后，溶解曲线的反应条件为：95℃持续15s，60℃持续1min，95℃持续15s。每个样品重复3次取均值，应用2-ΔΔCT法计算AMH基因的表达量[14]。用SPSS17.0软件进行数据统计分析和显著性检验，P＜0.05时为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 黄颡鱼AMH基因序列分析

以黄颡鱼总RNA反转录所得cDNA为模板，经克隆扩增获得AMH基因的开放阅读框序列，而以黄颡鱼DNA为模板，经克隆扩增获得AMH的基因组序列。将两测序结果比对分析，确定其外显子及内含子的组成及序列信息，获得GenBank检索号MK310106。

黄颡鱼AMH全长3 588bp，其开放阅读序列为1 653bp，由7段外显子组成，可编码550个氨基酸序列，非编码序列包括959bp的5’-非编码区序列（5’-UTR）、6段内含子序列及 119bp的 3’-非编码区序列（3’-UTR）组成（图1A）。SMART分析表明，编码的氨基酸序列包含20个信号肽序列及9个半胱氨酸残基，含有 AMH-N区域（87～440）及TGF-β 结构域（458～550）（图 1B）。预测所得蛋白分子量为61.40 ku，理论pI为5.94，不稳定系数为49.66，该蛋白为不稳定蛋白。脂肪系数为85.25，亲水性系数为-0.331，表明其为亲水性蛋白。

2.2 AMH基因同源性分析

用Cluster W软件进行的氨基酸序列同源性比较表明（图2）：不同物种间的AMH氨基酸序列差异很大。本研究获得的AMH基因序列与已发表的基因序列进行比对发现，其与黄颡鱼Tachysurus fulvidraco的相似性最高，达99.6%，与低眼无齿Pangasianodon hypophthalmus及斑点叉尾的相似性也很高，分别达75.8%与74.8%，而与狮尾狒、黑猩猩等高等哺乳动物相似性最低。氨基酸序列的多重比对结果也进一步验证了这种同源性分析结论（图3）。这表明AMH在不同物种中的保守性并不高。

图1 黄颡鱼AMH的DNA全长序列及氨基酸序列Fig.1 The full-length DNA and deduced amino acid sequences of AMH in yellow catfish

进一步直观研究AMH的进化特征，利用Mega4.0软件中的NJ法绘制AMH基因的系统进化树（图4），所有的AMH序列都来源于硬骨鱼、哺乳动物等脊椎动物，GenBank检索信息如下：黄颡鱼（MK310106）、黄颡鱼 Tachysurus fulvidraco（XP_027 007942）、低眼无齿（XP_026803092）、斑点叉尾（XP_017333187）、墨西哥脂鲤Astyanax mexicanus（XP_022525495）、纳氏臀点脂鲤Pygocentrus natterer（iXP_017572294）、电鳗Electrophorus electricus（XP_026873942）、安水金线鲃 Sinocyclocheilus anshuiensis （XP_016327204）、 鲤Cyprinuscarpio（XP_018920046）、斑马鱼Danio rerio（XP_009294509）、犀角金线鲃 Sinocyclocheilus rhinocerous（XP_016395808）、滇池金钱鲃 Sinocyclocheilus grahami（XP_016138462）、四川裂腹鱼Schizothorax kozlovi（ASU44862）、 北 极 红 点 鲑Salvelinus alpinus（XP_023855208）、鲫 Carassius auratus（AHL68989）、核雅罗鱼 Squalius pyrenaicus（ABX55992）、黑鲫 Carassius gibelio（AKP99417）、虹鳟 Oncorhynchus mykiss（XP_021459508）、浪白鱼Anabarilius graham（iROL40795）、大鳞大麻哈鱼Oncorhynchus tshawytscha（XP_024277327）、大西洋鲑Salmo salar（ADJ38820）、Seriolalalandi dorsalis（XP_023263819）、人 Homo sapiens（EAW69397）、黑猩猩 Pan troglodytes（XP_016790129）、狮尾狒Theropithecus gelada（XP_025222375）。分析结果如图4所示，除一种Seriola lalandi dorsalis进化地位比较特殊外，所有的AMH均可为两个大分支：哺乳动物为一支，其他鱼类为另一支。黄颡鱼AMH先与斑点叉尾、低眼无齿等鲶形目物种聚集成簇，再与电鳗、纳氏臀点脂鲤等聚类。

图2 黄颡鱼AMH同其他脊椎动物AMH氨基酸同源性比较Fig.2 Comparative homology of the amino acid sequences of yellow catfish AMH with other vertebrate AMH

2.3 黄颡鱼AMH基因的mRNA表达

Real-Time PCR检测AMH基因在不同生长阶段黄颡鱼的脑、鳃、肾、肝、脾、性腺、肌肉及血液中的表达情况（图5）。结果表明，AMH基因的mRNA在不同组织中的表达水平差异很大。1龄雄鱼各组织的表达量显著高于1龄雌鱼，尤其是性腺、肝、肾中，雄性表达量远远高于雌性，只有在脾中，雄性表达量略低于雌性；2龄鱼中，AMH基因的表达量仅雄性的性腺、脾中显著高于雌性，而在雄性脑和血液中表达量又明显低于雌性，在其他的组织中的表达基本相似。

3 讨论

Miura等（2002）在日本鳗鲡中发现了第一个鱼类的AMH基因，随后在大西洋鲑Salmo salar、日本青鲽 Paralichthys olivaceus、斑马鱼 Danio rerio、青Oryzias latipes、奥利亚罗非鱼Oreochromis aurea等鱼类中相继开展了AMH的克隆研究工作[10]。

本研究首次扩增获得了黄颡鱼的AMH基因，全长3 588bp，其开放阅读序列为1 653bp，可编码550个氨基酸序列。测序结果经比对分析，与本项目组前期测序获得的黄颡鱼基因组上部分信息完全一致。BLAST分析将本研究扩增获得的AMH基因定位于基因组序列2号染色体chr2的19371164～19374761区间。SMART分析表明，黄颡鱼AMH基因编码蛋白含有典型的AMH-N区域及TGF-β结构域。AMH-N结构域上的糖基化位点及TGF-β结构域上含有的特异性裂解位点，可有助于AMH形成蛋白二聚体，同时含有9个保守的半胖氨酸残基，这与之前的研究结论相一致，经验证该蛋白属于TGF-β超家族[15]。

图3 预测的黄颡鱼AMH氨基酸序列及与其他鱼类AMH氨基酸序列的比较。Fig.3 Predicted amino acid sequence of yellow catfish AMH and alignment with other teleost

起初关于AMH表达的研究主要集中在性腺组本研究初步对黄颡鱼的AMH进行了克隆分离与鉴定析，但其对性别分化及发育的调控作用还有待进一步研究。织，这是因为AMH在性别分化及发育中起重要的调控作用。后来的研究表明，AMH在斑马鱼的脑、肌肉、眼、皮肤、肾、肝和心等组织中都有表达[16]。本研究中黄颡鱼AMH的mRNA在脑、肌肉、肝等所检测的组织中均有表达且存在着极大的差异性。这与Rodríguez-Marí等（2005）对斑马鱼中 AMH 的表达结果相类似[17]。1龄雄鱼性腺中的表达量显著高于2龄雄鱼，这是因为黄颡鱼精巢分化大致始于孵出后55d。在性腺分化时期，与性别分化相关的基因处于较活跃状态，促进了AMH的表达。而在性成熟时期，精母细胞和雄性激素的协同作用又有效抑制了AMH表达[18]。该检测结果表明：AMH极可能在黄颡鱼的性别分化及生长发育过程中都发挥重要作用。

图4 NJ法构建黄颡鱼AMH与其他脊椎动物AMH系统树Fig.4 Phylogenetic tree of yellow catfish AMH and other species AMH based on the Neighbor-joining method

图5 AMH基因mRNA在黄颡鱼各组织中的表达水平Fig.5 mRNA expression level of AMH gene in different tissues of yellow catfish