Sox9和amh基因在雌、雄虹鳟和伪雄鱼各组织中的表达模式分析

谷伟，黄天晴，徐革锋，王炳谦

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

虹鳟Oncorhynchus mykiss的性别决定机制为XX/XY[1]，雌性虹鳟染色体为XX型，雄性为XY型。通过体外激素诱导全雌性虹鳟，可产生性反转功能性雄鱼，即染色体核型为XX，但可产生功能性精液的“伪雄鱼”。伪雄鱼与全雌性虹鳟杂交，通过静水压方法处理受精卵，阻止其第二极体排放，即可获得全雌三倍体虹鳟[2]。因此，伪雄鱼是大批量生产全雌三倍体虹鳟必不可少的条件。研究伪雄鱼性别特异基因表达模式，与普通雌性和雄性虹鳟的表达模式进行比较，对于全雌三倍体虹鳟制种技术具有重要的理论意义。

Sox9（SRY-related HMG box 9）基因是一种重要的转录因子，对哺乳动物精子发生以及维持精巢发育具有重要的作用[3]。硬骨鱼的sox9基因在性腺发育过程中显著表达，对生殖细胞与支持细胞的分化有重要的影响[4]。研究表明，sox9基因在雌雄虹鳟性腺中表达显著不同[5]。Amh（anti-Mullerian hormone）为抗缪勒氏管激素，是鱼类性腺向雄性分化的重要影响因子[6]。Amh在比目鱼和虹鳟精巢组织中的表达显著高于卵巢组织[7,8]。在受精后30d的斑马鱼Barchydanio rerio var中，amh为驱使其性腺雄性化发育的关键基因[9]。在天然性逆转雄性以及正常雄性的半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Gunther性腺中，amh基因的表达均显著高于正常雌性[10]。因此，sox9与amh为典型的硬骨鱼类雄性特异基因。

本研究以正常雌、雄性以及激素处理的伪雄虹鳟为实验对象，通过验证三者不同组织中雄性特异基因sox9和amh的表达情况，为挖掘sox9与amh基因的潜在功能和了解伪雄虹鳟的性腺发育提供依据，为虹鳟全雌三倍体制种技术研究奠定重要理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用雄性（XY）、雌性（XX）和伪雄（XX）虹鳟均为3龄鱼，采集于中国水产科学研究院黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼类试验站。通过人工诱导雌核发育技术建立全雌虹鳟基础群体，在此基础上采用17-α甲基睾丸酮诱导批量制备性反转功能性雄鱼，即为“伪雄鱼”。3龄雄性、雌性和伪雄虹鳟各选取5尾，麻醉后分别取性腺、背肌、腹肌、肝脏、后肠、中肠、前肠、脑、脑垂体、脾、肾脏、心脏以及幽门盲囊组织，将新鲜组织加入RNA保护液，于-80℃冰箱保存备用。

总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒均购自博日公司，RNA later购于Takara公司，用于保存组织样本，防止RNA降解。荧光定量试剂盒购于Roche公司。

1.2 总RNA提取

按照BioFlux Simply P总RNA提取试剂盒方法，先将雄、雌和伪雄虹鳟各组织在液氮中研磨。取不大于30mg组织粉末放入1.5mL离心管中，加入600 μL裂解液，室温静置 3～5min，取上清吸入纯化柱，12 000r/min离心30s，之后加入洗涤液，洗涤两遍，空离之后用50μL DEPC处理水洗脱，获得总RNA。提取的各组织总RNA经检测，OD260/OD280比值均处于 1.8～2.1 之间，浓度均大于 1 μg/μL。

1.3 cDNA合成

cDNA合成按照BioRT高灵敏cDNA第一链合成试剂盒操作，反应体系为 10 μL：Hybrid mix 5μL，Enzyme mix0.5μL，RNA2μg，补充 Nuclease-free水至 10 μL；反应程序为：37℃ 20min，98℃ 5min。反应结束后将cDNA放入-20℃保存，备用。实验全程戴一次性手套和口罩，防止污染，使用RNase-free移液枪头和离心管。

1.4 Real-time PCR

利用Real-time PCR检测雄、雌和伪雄虹鳟各组织中sox9和amh基因的表达。反应体系为10μL：SYBR Mix5μL，上、下游引物各 0.2μL，cDNA0.5μL，dH2O 4.1μL。反应程序为：95℃30s，95℃5s，60℃34s，40 个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。用于荧光定量PCR检测虹鳟sox9和amh基因的引物信息见表1。

1.5 数据统计分析

实时定量PCR结果利用2-△△CT方法分析sox9和amh基因的相对表达量，基因相对表达量用（Mean±SD）表示，两组数据间的差异比较利用One-way ANOVA方法，利用软件SPSS 12.0来分析不同组之间的显著性差异，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。

表1 实时定量PCR引物信息Tab.1 The primer sequences for Real-time PCR

2 结果与分析

由图1可知，sox9基因在伪雄、雄性以及雌性虹鳟的13种组织中均有表达，但在性腺中表达量最高，脑组织次之，在脾、肝以及脑垂体中表达量也分别达到了显著水平（P＜0.05）。Sox9基因在伪雄、雄性以及雌性虹鳟性腺组织中的表达量分别为背肌组织的 20.8、24.2以及 17.7倍（P＜0.01）。Sox9基因在这三种鱼性腺中的表达量为：雄鱼＞伪雄鱼＞雌鱼（P＜0.01）。而在脑组织中，该基因的表达量为：雌鱼＞雄鱼＞伪雄鱼（P＜0.05）。在肝和脾组织中，sox9在伪雄鱼中的表达量显著高于普通雌、雄鱼（P＜0.05）。Sox9基因在脑垂体中的表达量显著高于其他组织（P＜0.05），而在这三种鱼之间没有显著差异。

图1 Sox9基因在伪雄、雄性和雌性虹鳟不同组织中的表达模式Fig.1 Expression profiles of sox9 gene in different tissues of pseudo-male,male and female rainbow trout

Amh基因的表达模式见图2。该基因在伪雄、雄性以及雌性虹鳟性腺以及脑组织中的表达显著高于其他组织（P＜0.01或 P＜0.05）。Amh基因在三种鱼性腺中的表达分别为背肌的12.7、11.0以及5.4倍（P＜0.01）。Amh基因在伪雄鱼性腺中的表达显著高于雄、雌鱼的性腺（P＜0.01）。Amh基因在伪雄鱼脑组织中的表达显著高于雄鱼和雌鱼（P＜0.05）。该基因在本研究的其他11种组织中的表达差异不显著。

图2 Amh基因在伪雄、雄性和雌性虹鳟不同组织中的表达模式Fig.2 Expression profiles of amh gene in different tissues of pseudo-male,male and female rainbow trout

3 讨论

本研究利用实时定量PCR方法，检测了伪雄鱼和正常雌、雄虹鳟背肌、腹肌、肝脏、前肠、中肠、后肠、脑、脾脏、肾脏、心、脑垂体以及性腺中sox9和amh基因的表达模式，验证了激素诱导对关键性别特异基因表达的影响。利用雄激素处理得到的能产生正常精液的伪雄鱼，在生产全雌虹鳟过程中起到重要作用，因此，开展伪雄虹鳟性别特异基因的表达研究具有重要的理论意义。

Sox9基因在雌、雄和伪雄虹鳟的13种组织中的表达表明，该基因在性腺和脑中的表达显著高于其它组织，这与黄颡鱼和鲟鱼中的结果一致[11,12]，表明sox9基因在许多组织中广泛表达。研究表明：sox9基因负调控芳香化酶基因的表达[13]，而芳香化酶为雌激素合成过程中的限速酶[14]，因此，sox9基因的表达抑制了雌性激素的合成。本实验中，伪雄虹鳟性腺中sox9的表达显著高于雌性卵巢中，表明甲基睾丸酮处理的虹鳟，促进了性腺中sox9基因的表达，抑制了芳香化酶的表达，导致其性腺向雄性发育。虽然，虹鳟为XY型的性别决定[1]，但其性腺的发育可受到激素的影响[15]。本研究以雄激素处理的虹鳟伪雄鱼为研究对象，验证了sox9基因高水平表达可能为其性腺雄性化的关键原因之一。然而，伪雄性腺中sox9基因的表达仍然显著低于雄性精巢，推测基因型对性别决定的作用大于外源激素的诱导。本实验还表明，sox9基因在雌性脑组织中的表达显著高于雄鱼和伪雄鱼，表明性腺细胞中分泌的雌激素会抑制脑组织中激素的分泌，从而导致sox9基因的表达升高。值得注意的是，sox9基因在肝脏和脾脏中呈显著的高表达，伪雄鱼这两种组织中的表达显著高于其他两种性别，而肝脏和脾脏均为鱼类重要的免疫器官[16,17]，因此sox9基因是否具有免疫作用值得深入研究，同时，探索伪雄鱼的非特异性免疫与特异性免疫能力也具有重要的作用。

Amh基因在雌、雄性与伪雄虹鳟的性腺和脑中呈现显著的高表达，而在其他组织中的表达却微乎其微，这与在罗非鱼和半滑舌鳎中得到的结果相似[18,19]。Amh基因可抑制缪勒氏管的分化[20]，硬骨鱼类一般不存在缪勒氏管结构，但其对硬骨鱼类精巢的发育起到重要的作用。本实验结果显示，amh基因在伪雄鱼性腺中的表达显著高于雌性，甚至显著高于雄性，暗示amh在虹鳟性反转的过程中扮演重要的角色，促进其向雄性发育。伪雄虹鳟受到雄性激素的处理，amh在脑组织中的表达也显著高于雌性与雄性虹鳟。可以推测，雄激素的处理诱导了脑中amh基因表达的上调，抑制了其雌性激素的分泌，最终导致个体雄性化逆转。

总之，伪雄虹鳟各组织中雄性特异基因sox9和amh的表达模式可为深入了解伪雄鱼的性腺发育模式奠定理论基础，对于实现全雌性虹鳟规模化制种技术提供了参考。