一株野生侧耳菌种鉴定及生物学特性

孙瑞泽 张耀玲 王胜宝 刘勇 陈进 黄重 魏玲 魏芳勤 荆丹 陈永刚 王艳龙 瞿艳丽 高红玲 杨秀丽

摘  要：以1株野生侧耳属菌株为试验材料，采用ITS测序、同源序列比对、构建系统发育树进行鉴别，通过单因素试验确定影响其菌丝生长的因素。结果表明：该野生侧耳属菌株为哥伦比亚侧耳（Pleurotus columbinus），其菌丝生长的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为牛肉膏，最适碳氮比为10∶1，最适pH值为6.0，最适培养温度为25～30℃。

关键词：哥伦比亚侧耳;ITS测序;生物学特性

中图分类号 S646.14   文献标识码 A   文章编号 1007-7731（2019）09-0034-4

Abstract：A wild Pleurotus strain was used as a test material. The wild strain was identified by ITS sequencing， homologous sequence alignment and phylogenetic tree construction. The biological characteristics were determined by single factor test.The results showed that the wild Pleurotus strain was identified as Pleurotus columbinus， the best carbon source was sucrose，the best nitrogen source was beef extract，the optimum carbon to nitrogen ratio was 10：1，the optimum pH value was 6.0， and the optimum culture temperature range was 25-30℃.

Key words：Pleurotus columbinus;ITS sequencing;Biological characteristics

側耳属真菌营养价值较高，具有重要的经济价值和药用价值，是我国栽培面积较大的食用菌种类[1-2]。侧耳属的传统分类及鉴定主要是基于子实体的宏观形态和微观结构特征的由于其子实体形态受到地域分布、子实体发生时间以及环境条件等因素的影响而出现不稳定性，且一些近缘物种的子实体形态非常相似，仅仅依靠外形很难分辨，因而传统的分类方法已无法满足一些未知种属真菌的分类及鉴定要求[3-4]。随着分子生物学的发展，许多学者利用分子生物学技术进行菌物系统发育和菌种辅助鉴定，其中以ITS序列分析技术应用最为广泛。rDNA的ITS序列具有高度保守性，表现为种内相对一致，同时也有可以变化的区域，其有较为丰富的变异位点，这为种属间的区分提供了可能[5]。本研究以采自秦巴山区的1株野生侧耳菌株进行ITS测序及同源序列比对，通过构建系统发育树鉴定该菌株为哥伦比亚侧耳（Pleurotus columbinus）;同时，对其生物学特性开展了研究，旨在明确该菌株的最适碳源、氮源、碳氮比、pH值、温度等生理指标，为其后续驯化栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试野生侧耳菌株于2017年采自陕西省镇巴县小洋村，经组织分离获得原种备用。

1.2 试验方法

1.2.1 野生侧耳菌株的分子鉴定 采用DNA提取试剂盒提取DNA，利用通用引物ITS1、ITS4进行PCR扩增，将扩增后的PCR产物送上海生工进行ITS序列测序，测得序列登录NCBI网站用Blast工具进行同源序列比对，从GenBank下载搜索到排名前6位同源序列的ITS序列，应用MEGA-X软件进行系统发育分析，采用kimura2-parameter模式计算遗传距离，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，Bootstrap参数设定为1000。

1.2.2 影响菌丝生长因素的确定

1.2.2.1 碳源 参照张国广等[3]方法进行，以葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素B110mg，琼脂20g）中20g葡萄糖的含碳量为标准，分别用与20g葡萄糖相等含碳量的玉米粉、麦芽糖、果糖、淀粉、蔗糖代替葡萄糖进行碳源因子比较试验，观察不同碳源处理对菌丝生长的影响。

1.2.2.2 氮源 以葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素B110mg，琼脂20g）中5g蛋白胨的含氮量为标准，分别用与5g蛋白胨相等含氮量的硝酸铵、硫酸铵、谷氨酸、酵母浸粉、牛肉膏、硝酸钾、尿素代替蛋白胨进行氮源因子比较试验，观察不同氮源处理对菌丝生长的影响。

1.2.2.3 碳氮比 在葡萄糖蛋白胨琼脂培养基中，改变蛋白胨添加量配成碳氮比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的培养基，观察不同碳氮比处理对菌丝生长的影响。

1.2.2.4 温度 在葡萄糖蛋白胨琼脂培养基中，分别设置15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等5个培养温度，观察不同温度处理对菌丝生长的影响。

1.2.2.5 pH值 在葡萄糖蛋白胨琼脂培养基中，调节pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，观察不同pH值处理对菌丝生长的影响。

1.3 项目测定 以上每个处理3次重复，接种后每日观察菌丝生长情况，直至其中1个处理中菌丝长满培养皿后停止观察，测量菌丝生长长度，计算菌丝生长速率[3]。菌丝生长速率（mm/d）=菌丝生长长度/培养天数

1.4 数据分析 数据用平均值±方差的方式表述。对各处理菌丝平均生长速率进行方差分析，用新复极差法进行多重比较和显著性分析（P<0.01为差异极显著，P<0.05为差异显著）[3]。