精神分裂症疾病诊断标志物circRNAs筛选及验证☆

袁洋 楚璐萌 魏雨菲 刘雪玲 曾凌星 张红星△ 于海川△○☆

SCZ是一组感知、思维、情感、行为等多方面精神活动出现障碍的重性精神病[1-3]。临床上，SCZ诊断依赖于对患者症状判定，缺乏特异的分子诊断标志物。circRNAs是新近确认的一类非编码RNA，形成无5’和3’末端的闭合环状结构，具有结构稳定、高丰度的特点，并且在细胞或组织中特异性表达[4-6]。研究发现circRNAs在哺乳动物的大脑中表达丰富，参与调控大脑发育和神经发生，并且与多种神经精神疾病相关，如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症和精神分裂症等[7-9]。本研究使用全转录组测序对SCZ患者外周血单个核细胞的circRNAs表达谱进行分析，系统地筛选SCZ患者差异性表达的circRNAs，经实时荧光定量PCR（real-time PCR）验证寻找可作为SCZ潜在诊断标志物的circRNAs。

1 对象与方法

1.1 研究对象SCZ患者来源于2017年2月至2018年10月新乡医学院第二附属医院就诊的SCZ患者。纳入标准：①由超过2名具有精神疾病诊断资格且主治医师以上职称的医师诊断，符合《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnostic and StatisticalManualofMentalDisorders,Fourth Edition,DSM-Ⅳ）SCZ诊断标准；②阳性与阴性症状量表 （positive and negative symptoms scale，PANSS）评分＞60分；③超过两周未使用任何抗精神病药物；④18～65岁。排除标准：①患有心胆肝肾等躯体疾病，内分泌、免疫系统疾病，或者营养不良；②患有其他精神疾病；③有过敏史、激素治疗史或者接受过免疫制剂治疗；④妊娠或哺乳期妇女。共入组175例患者。

对照组来源于同时期医院招募的豫北地区志愿者。纳入标准：①经DSM-IV-TR轴I障碍定式临床检查非患者版 （the Structured Clinical Interview for DSM-IV-TR Axis I Disorders，Nonpatient Edition，SCID-I/NP）筛查，无精神疾病临床诊断；②无精神病史及精神疾病家族史；③18～65岁。排除标准同患者组。共入组200名对照。

本研究通过新乡医学院伦理委员会审批。所有受试者均签署知情同意书。

1.2 RNA提取和逆转录所有被试在治疗前用EDTA抗凝管采集外周血样本5 mL。使用外周血淋巴细胞分离液梯度离心法分离单个核细胞，按照Trizol说明书一步法从单个核细胞中提取总RNA，使用微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）进行RNA浓度定量，通过凝胶电泳检测RNA完整性。使用逆转录试剂盒，在20 μL逆转录反应体系中，将1.0 μg总RNA逆转录为cDNA。

1.3 全转录组测序分析选择年龄、性别和民族相匹配的SCZ患者和对照外周血单个核细胞总RNA样品各60份，每20份等量混合成1份RNA混合样品，分别获得3份患者RNA混合样品（C1-C3）和3份对照RNA混合样品 （N1-N3）。使用Hiseq 4000测序系统PE150平台对每份混合样品分别进行全转录组测序。使用CIRI软件[10]检测和鉴定 circRNAs，并使用circBase数据库[11]对所鉴定的circRNAs进行注释。对测序数据进行标准化，使用独立样本t检验分析两组样品的差异circRNAs，筛选两组表达量倍数在2倍以上且差异有统计学意义（检验水准α=0.05）的circRNAs。使用R软件对全转录组测序所得的原始数据进行分位数归一化处理，绘制差异表达circRNAs的非监督层次聚类图和火山图。

1.4 实时荧光定量PCR根据上述测序结果选择表达丰度较高的20个circRNAs在已送测序的60例SCZ患者和60名对照样品中进行real-time PCR验证，得到与测序结果一致的circRNAs作为候选circRNAs。然后在175例SCZ患者和200名对照中使用real-time PCR进一步确证。real-time PCR使用PikoReal TM实时荧光定量PCR检测仪（Therom Fisher Scientific公司）。引物见表1。

1.5 统计学方法运用SPSS 19.0进行统计分析，两组年龄比较采用独立样本t检验，性别比较采用χ2检验。采用GraphPad Prism 6.0对real-time PCR结果进行分析，结果以均数±标准差（x±s）描述，组间比较采用非配对t检验。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 人口学资料SCZ组和对照组均为来自豫北地区的汉族人口。SCZ组共纳入175例患者，其中男 99 例，女 76 例，年龄（33.2±10.0）岁。 对照组共纳入200名，其中男106名，女94名，年龄（40.2±9.6）岁。SCZ 组和对照组性别（χ2=0.480，P＜0.001）、年龄（t=-6.930，P＜0.001）差异有统计学意义。

2.2 样本总RNA提取与质检结果SCZ和对照测序样品中提取的 RNA总量均≥2 μg，A260/A280为 1.9～2.0， 电泳条带清晰，28S、18S、5S 条带亮度清晰，且28S与18S之比为2:1，提示所有样本RNA质量均达到质检标准。RNA混合样品电泳结果见图1。

表1引物列表

图1 全基因组测序样本总RNA电泳图。C1-C3为SCZ患者混合RNA测序样本，N1-N3为对照混合RNA测序样本

2.3 circRNAs表达水平非监督层次聚类分析全转录组测序后，绘制差异表达circRNAs非监督层次聚类图，见图2。结果表明SCZ组和对照组的circRNAs表达谱存在统计学差异（P＜0.05）。

图2非监督层次聚类图。N1-N3为对照组混合RNA测序样本，C1-C3为SCZ组混合RNA测序样本，图中红色表示circRNAs表达量相对高，蓝色表示circRNAs表达量相对低

2.4 差异表达的circRNAs火山图分析通过绘制火山图观察差异表达circRNAs的整体分布情况。由图3可见，在精神分裂症患者外周血单个核细胞中存在差异性表达的circRNAs。

2.5 全转录组测序获得差异表达的circRNAs全转录组测序共检测到23418条circRNAs。将其与基因元件比较，获得circRNAs在基因组上的位置，可以将circRNAs分为以下5类：exonic circRNAs、introniccircRNAs、 antisensecircRNAs、 senseoverlapping circRNAs、intergenic circRNAs。 分类统计信息见图4。SCZ患者组和对照组相比，存在差异表达的 circRNAs共 195 个（差异倍数≥2，P＜0.05），其中SCZ患者表达上调的circRNAs有83个，表达下调的circRNAs有112个。

图3 火山图。每个点均表示一个circRNA，横坐标为circRNA在两组样品中表达量差异倍数的对数值，其绝对值越大，说明两组间的表达差异越大；纵坐标为-log10 P值，P值越小，该值绝对值越大，表明筛选得到的差异表达circRNAs越可靠。图中绿色的点代表circRNAs表达量下调，红色的点代表circRNAs表达量上调，灰色的点代表circRNAs表达量在组间无统计学差异

图4circRNA基因结构分布图

2.6 real-time PCR验证差异表达的circRNAs根据测序和分析结果选择表达丰度较高的20个circRNAs，见表 2。

2.6.1小样本量real-time PCR验证在已送测序的60例SCZ和60名对照样品中进行real-timePCR验证，结果表明circRNA_16588（circbase_id：has_circ_0004669）表达量（0.479±0.080vs.1.022±0.012，t=6.434，P=0.003） 和 circRNA_12825（circbase_id：has_circ_0004442）表 达 量 （0.387±0.050vs.1.372±0.230，t=4.256，P=0.013）在 SCZ 患者组和对照组表达差异具有统计学意义，二者均在SCZ患者外周血单个核细胞中表达下调，与测序结果相一致。

表2 全基因组测序real-time PCR验证差异表达的circRNAs（差异倍数≥2，P＜0.05）

2.6.2大样本量real-time PCR验证 将hsa_circ_0004669和hsa_circ_0004442作为候选circRNAs在175例SCZ患者和200名对照中进行real-time PCR确证，SCZ组hsa_circ_0004669表达量（0.583±0.050vs.0.910±0.060，t=4.312，P＜0.001）和hsa_circ_0004442 表达量 （0.680±0.080vs.1.219±0.090，t=4.334，P＜0.001）均低于对照组，且差异有统计学意义。

3 讨论

SCZ是环境和遗传因素共同作用的结果，其大多数遗传突变位点发生在人类基因组的非编码区[12-14]。研究表明非编码 RNA，包括微小RNAs（microRNAs，miRNAs）、长非编码 RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs） 和 circRNAs与 SCZ 密切相关[15-16]。近年研究已在SCZ患者脑组织中发现许多差异性表达的非编码RNA[17-18]。由于脑组织不易获得，检测血液非编码RNA表达相对简便可行，并且非编码RNA在血液和脑组织中表达具有一定的一致性，因此在血液中寻找SCZ诊断标志物成为研究热点[19]。使用基因芯片和PCR验证的方法在外周血单个核细胞中已发现部分可作为SCZ诊断标志物的非编码RNA，如miR-30e、miR-130b、miR-132 以及 NONHSAT 041499 等[20-22]。

circRNAs是一种新型非编码RNA，参与广泛的生物过程，影响基因转录、mRNA剪接、RNA衰变和翻译等，在哺乳动物的大脑中高度表达，尤其是在神经突触小体[23]。近年研究表明circRNAs与抑郁症、精神分裂症相关联[12,24]。circRNAs在唾液、血液、组织和外泌体中表达非常稳定[25-28]。因此研究SCZ患者外周血单个核细胞circRNAs表达谱具有潜在临床意义和实用价值。

目前关于circRNAs与SCZ诊断标志物的相关研究国内外尚无报道，并且circRNAs在SCZ中差异性表达也鲜有报道。本研究通过全转录组测序，发现SCZ患者外周血单个核细胞中存在显著差异性表达的circRNAs，并使用real-time PCR验证发现has_circ_0004669和has_circ_0004442在SCZ患者外周血单个核细胞中表达显著下降。

尽管本研究已经获得初步结果，找到部分差异表达的circRNAs，但仍存在尚未解决的问题：①circRNAs表达在脑组织中是否与外周血中结果一致；②差异表达的 circRNAs，如 has_circ_0004669和has_circ_0004442，在SCZ发病机制中有何作用；③抗精神病药物治疗对这些circRNAs的表达有何影响。进一步研究将围绕上述科学问题，在继续加大样本量验证的同时，对SCZ患者用药前后has_circ_0004669和has_circ_0004442表达变化进行检测，为SCZ诊断和抗精神药物治疗效果评价提供新的支持。

综上所述，SCZ患者外周血单个核细胞存在显著的差异性表达circRNAs，本研究发现并验证has_circ_0004669和has_circ_0004442在SCZ患者外周血中表达显著下调。它们有望成为SCZ潜在诊断标志物，协助临床进行SCZ早期诊断，但其作用机制还需进一步研究探讨。