温肾活血方对RCS大鼠视网膜变性损伤的保护作用

向圣锦 李佳 窦仁慧 姜小涵 李柏村

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP) 是一组以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为共同表现的遗传性视网膜变性疾病, 临床以夜盲、进行性视野损害、眼底特征性改变和视网膜电图异常或无波为其主要临床特征，是最常见的遗传性致盲眼病之一[1]，至今未发现确切有效治疗RP的方法。中医药治疗RP有着悠久的历史，一些药物临床与实验研究均被证实对本病有一定疗效[2-3]。现在中医学逐渐总结和认识到肝肾阴虚、脾肾阳虚、清阳不升和血瘀脉涩是RP的重要病机[4]。同时我们对历代治疗RP的方剂配伍和临床用药规律总结发现，自近代医家以来，应用温补肾阳兼活血祛瘀法治疗RP的报道亦越来越多[5]。临证中，我们应用温肾活血方(熟附子、肉桂、枸杞子、菊花、红参、丹参等)为主加减治疗肾阳不足型RP，获得不错的临床效果。为进一步明确温肾活血方治疗本病的疗效机理，本研究以皇家外科学院(royal college surgeons, RCS)大鼠为研究对象，观察中药温肾活血方对RCS大鼠视网膜变性损伤的保护作用，以丰富中药治疗RP的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠购自苏州昭衍新药研究中心有限公司，质量合格证号：NO.201910067，SPF级；正常SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，质量合格证号：NO.201614068)；经温州医科大学动物伦理委员会批准。RCS大鼠按照4雌2雄进行交配得到纯合子胎鼠RCS(rdy-/-,p-/-)24只(雌雄各半)；SD大鼠8只，雌雄各半，鼠龄2周龄。所有大鼠均饲养在湖北中医药大学实验楼动物实验中心，SPF级动物房饲养，标准颗粒饲料和无菌蒸馏水喂养，自由饮食，室内通风良好，室温22～25℃；予以12h/12h的昼夜节律，光照时间6：00～18：00，每3～4 d更换一次垫料。

1.2 主要试剂及仪器

补肾活血方(熟附子、肉桂、枸杞子、菊花、红参、丹参和炙甘草)。上述药物按原方购买三九制药有限公司浓缩中药配方颗粒，按体表换算系数换算后配置成相应浓度后，真空包装，4℃冰箱保存备用。Tunel凋亡荧光染色试剂盒，普洛麦格(北京)生物技术有限公司；CRM-440切片机，日本SAKURA公司；光学显微镜，日本Olympus公司，Axio Observe.Z1全自动倒置荧光光学显微镜。无水乙醇、异丙醇、氯仿(北京化学试剂公司)；水合氯醛(国药集团工业股份有限公司)。

1.3 分组及给药

24只RCS大鼠按随机数字表法分为高浓度中药组、低浓度中药组和模型组，每组8支，雌雄各半；同时设8支SD大鼠为正常对照组(正常组)。自2周龄开始喂药：(1)高剂量中药组、低剂量中药组予温肾活血方中药浓缩颗粒剂灌胃，高剂量中药组灌胃浓度按中药浓缩颗粒10.29g/Kg体重计算，低剂量中药组灌胃浓度按中药浓缩颗粒3.43g/Kg体重计算，初始灌胃量为0.5ml/次，每日两次，1周后(出生3周)改为1.0mL，每日1 次。(2) 模型组和正常组：给予0.9%生理盐水灌胃，方法及频次同中药组。3组均于开始治疗后28天随机选取6只大鼠处死，进行相应操作和各个实验指标测定。

1.4 视网膜组织病理学检查

水合氯醛麻醉过量处死各组大鼠，快速取出右眼眼球置于4%多聚甲醛中固定48h，然后组织脱水、石蜡包埋，每组随机选择3只眼球沿冠状面行4μm连续切片，苏木精--伊红染色(HE染色)后于100倍光学显微镜下观察视网膜各层形态和结构变化并拍照，选取视盘两侧各150μm外外核层细胞核计数，并进行统计学分析。

1.5 TUNEL法检测感光细胞凋亡

取材时间和方法同上，制作视网膜石蜡包埋切片。按照TUNEL试剂盒说明进行相关检测。切片DAPI复染后荧光显微镜下观察，自视盘向锯齿缘方向连续取3个视野，500μm/视野，记录每个视野中阳性细胞数及感光细胞总数，抽样6张不同切片，计算平均值，统计感光细胞凋亡率。细胞计数采用3Y-Pixel-PRO 分析软件，感光细胞凋亡率(%) = 阳性细胞数/感光细胞总数×100%。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠视网膜组织病理学变化

治疗后28天，正常组SD大鼠视网膜各层结构完整，外核层感光细胞排列紧密整齐，其外侧依次可见感光细胞的内节与外节。模型组大鼠视网膜内核层及外核层均较正常组明显变薄，细胞排列疏松，欠整齐；外层感光细胞数明显减少，缺少外节，其余结构基本正常。温肾活血方高、低浓度组大鼠视网膜内核层及外核层亦较正常组变薄，感光细胞数量减少；但与模型组比较视网膜更厚，感光细胞层数较后者为多，细胞排列也较为整齐(图1)。细胞计数显示，空白组、模型组、低剂量中药组、高剂量中药组每个高倍视野感光细胞数分别为(205±8)、(52±5)、(75±7)和(120±9)个。统计学分析显示，模型组大鼠视网膜感光细胞数目较空白组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.00)，温肾活血方低浓度中药组和高浓度中药组较模型组总体差异有统计学意义(P<0.05)，且高浓度中药组明显高于低剂量中药组(P<0.05)。说明补肾活血方能延缓RCS大鼠视网膜变性，且高浓度中药显示出更好的治疗效果。

2.2 各组大鼠TUNEL法检测视网膜感光细胞凋亡情况

治疗后28天，正常组大鼠在视网膜外核层(感光细胞层)偶见阳性细胞，但模型组和温肾活血方不同浓度组大鼠视网膜外核层阳性染色细胞较正常组均明显增多，出现明显的细胞凋亡现象(图2)。模型对照组感光细胞凋亡率为(52.43%±6.22%)，低浓度中药组为(40.06%±6.64%)，高浓度中药组(28.94%±6.56%)，三组间比较差异有显著统计学意义(P<0.05)。两两组间比较，温肾活血方高、低剂量组感光细胞凋亡率明显低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。低浓度中药组、高浓度中药组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组大鼠视网膜组织HE染色

图2 各组大鼠视网膜组织TUNNEL染色

3 讨论

RP属于中医学“高风内障”、“高风雀目”、“阴风障”范畴。《目经大成·阴风障》[7]记载本病：“大道行不去，可知世界窄，未晚草堂昏，几疑天地黑”；《秘传眼科龙木论·高风雀目内障》[6]中记载其症状为“惟见顶上物”。形象地说明了RP以夜盲和逐渐进性视野缩窄为临床特征。《杂病源流犀烛?目病源流》[8]曰：“本病亦有生成如此,并由父母遗传”。这是世界上关于该病具有遗产性的最早记载[4]。目前，中医学认为本病的发生主要是由于先天禀赋不足所致。或肾阳不足，命门火衰；或肝肾亏损，精血不足；或脾胃虚弱，清阳不升而致[4]。因此，对于本病的治疗大多从肝脾肾论治。该病目前没有可以治疗的办法，大量临床研究显示，中药、针灸以及针药联合的中医药疗法可以部分改善患者视功能，延缓病情进展[2]。

历代医家多认识到元阳(肾阳)不足在本病发病中具有重要作用。《目经大成》[7]认为该病的病机为元阳不足，阳不胜阴所致，曰“至晚不见，晓则复明，盖元阳不足致病”；“人而阳不胜阴，则气必下陷，阳气下陷，则阴气升腾，纵有火光月色，终不能睹”。《审视瑶函》[9]认为该病“盖元阳不足致病，或曰既阳不足”。《眼科金镜》[10]认为该病是由于“阳光不足，肾阴虚损所致，乃阳微阴盛”所致。因此，先天禀赋不足，元阳不足，命门火衰；阴阳互根阳虚日久，必损及阴，阴阳俱衰，阴阳不济，阳气不能为用。同时，阳虚无以鼓动血行，目中脉络瘀阻，气滞血瘀。李传课教授团队研究证实RP证候具有虚中夹瘀的特点[11]。因此禀赋不足，命门火衰，阳损及阴，阴阳不济，终致目中脉络瘀阻，气血瘀滞是本病的重要病机[4,8]。现代临床研究也证实[12]：RP的发生常合并有视网膜血管进行性闭塞，脉络膜血管变细。说明该病的发生和目中脉络瘀阻，气滞血瘀，目失所养密切相关。肾之阴阳俱损，五脏之精气不能上承，视衣失其精血荣养，故神光呆滞，夜间昏盲，视界渐窄, 似以管窥物。因此，肾阳不足、并由此导致的目中脉络淤阻，气滞血瘀是本病的主要病机，治疗当温肾助阳、补肾填精，兼以益气活血。而温肾助阳、补肾填精之重在于温肾助阳。

温肾活血方选用大热之熟附子、肉桂温补肾阳，枸杞、菊花滋补肾阴、益精明目，阴阳双补，并可阴中求阳，共补肾中真精元阳，具体较好的补肾明目功效。方中配以红参大补元气，以助升阳，丹参活血化瘀通络；炙甘草调和诸药。诸药合之，共奏温补肾阳、益精明目，补气活血之功，切中病机。现代医学研究发现，红参能抑制糖尿病大鼠神经节细胞的凋亡，具有神经保护作用[13]。丹参具有改善微循环及血液流变性的作用，其所含的丹参素能增强视网膜血管及视神经纤维的耐缺氧能力，改善缺血缺氧损伤所致的线粒体氧化磷酸化功能障碍，使细胞凋亡和坏死的百分率明显降低[14]。

RCS大鼠是一种较成熟的视网膜退化性病变动物，因视网膜色素上皮细胞吞噬光感受器细胞外节盘膜能力缺陷，导致大量的盘膜碎片堆积，最终导致光感受器细胞进行性变性和凋亡，是一种常染色体隐性遗传病，具有人类RP的主要特征，是广泛用于RP病因及治疗方法研究的经典模型鼠[15]。既往研究发现，在出生14天时视网膜结构正常，之后睁眼并接受光线刺激后开始视网膜变性，在出生后28天时，可见视网膜明显变薄，感光细胞层数减少，外节不规则甚至消失，到42天时视网膜变性进一步加重，56天时则视网膜外层光感细胞完全消失[16]。因此，我们选择出生后42天进行相关检测，即在视网膜感光细胞损伤较为严重阶段，评估温肾活血方对视网膜感光细胞的保护作用。

本研究结果显示，RCS大鼠视网膜外核层随着鼠龄增加视网膜外层逐渐变薄，细胞核排列渐变疏松且数目减少；经不同浓度温肾活血方治疗后，视网膜各层结构排列相对规整，视网膜外层感光细胞层数以及细胞核密度较模型组有不同程度改善，且以较高剂量治疗效果更为显著，说明视网膜形态和结构得到了改善，且以较高剂量浓度改善更为显著。同时，我们对视网膜组织进行感光细胞凋亡检测，染色结果显示凋亡阳性细胞表达程度与外核层变薄的程度具有一致性，且高浓度温肾活血方较低浓度组更能较少感光细胞凋亡，提示温肾活血方可以减少RCS大鼠视网膜感光细胞凋亡，对视网膜损伤具有一定保护作用。既往也研究发现，温阳益气活血方可以有效抑制RDS小鼠感光细胞的凋亡，保护视网膜外层损伤[3]。结合我们研究结果，进一步说明温肾活血法在治疗视网膜色素变性中具有重要作用。

综上所述，本研究进一步证实温肾活血方对遗传性视网膜色素变性RCS大鼠视网膜感光细胞变性具有一定的保护作用，能够延缓感光细胞变性和凋亡的进程，但具体的作用机制还有待进一步研究。