基于纳米水凝胶颗粒的毛细管电泳法分离DNA

张禾蓉 易达 孟子晖 薛敏 汪海林 冯金生

摘 要 采用乳液聚合法，在水相中制备了一系列纳米水凝胶颗粒（NPs），基于动态涂层法应用于毛细管电泳分离DNA片段。动态光散射表征结果表明，所制备的NPs分散性好、粒径分布均匀。基于NPs交联网络结构将其作为毛细管电泳分离介质，结果表明，单体的用量、纳米颗粒的粒径以及NPs在毛细管电泳中的浓度对DNA分离效果都有影响。当单体采用N-异丙基丙烯酰胺（87%）、丙烯酸羟乙酯（8%）和丙烯酸（4%），交联剂为N，N'-亚甲基双丙烯酰胺（1%）时，通过改变表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）的用量，可以改变所制备的纳米颗粒粒径，当SDS用量为53 mg时，NPs粒径约480 nm。将此NPs（8.0 mg/mL）加入TG缓冲溶液（25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，pH 8.3）用于毛细管电泳，3个长度DNA片段（20、50和80 nt）可实现完全分离，分离效果好，且迁移时间较短。

关键词 纳米水凝胶颗粒; 毛细管电泳; DNA分离

1 引 言

毛细管电泳（Capillary electrophoresis， CE）是以熔融石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分析技术[1]，具有高效、高分辨率、高灵敏度等特性，在核酸、多肽、蛋白质等生物大分子的分离分析中应用广泛[2～4]。CE用于DNA分析时，通过在毛细管柱中充入凝胶或聚合物溶液等筛分介质形成凝胶色谱柱，依据DNA片段大小和形状可以在电泳过程中实现筛分分离[5]。这种凝胶毛细管柱虽然分离效率较高，但是高粘度交联的聚合物会导致毛细管柱难以制备和维护，近年报道的亲水性聚合物溶液筛分体系的应用，很好地解决了这个问题[6]。 Heiger等[7]率先将线性聚丙烯酰胺（Linear polyacrylamide，LPA）用于CE分离DNA，实现了片段长度达12000的碱基对的双链DNA的高效分离。然而，LPA溶液的粘度较高，而且使用LPA溶液时，必须通过化学衍生的方法在毛细管内壁形成一层LPA聚合物涂层，减少DNA片段在毛细管内壁上的吸附以及抑制电渗流（EOF）[8]。这种共价涂层毛细管制备比较复杂，使用寿命短，且难冲洗。研究表明，一些聚合物溶液能够形成比较稳定的动力学涂层，可用于分离DNA，其机理是通过聚合物溶液和毛细管内壁之间的相互作用（如氢键、疏水作用以及静电作用等）形成的一种物理吸附[9]。常用的聚合物包括聚二甲基丙烯酰胺（PDMA）、聚环氧乙烯（PEO）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。Gao等[10]合成了一种新型的星状PDMA，将其作为基质用于DNA分离，与线性聚合物相比，该聚合物提高了筛分能力，缩短了分离时间，获得了较好的分离性能。李玉荣等[11]以PEO为筛分介质，采用硅烷化处理的毛细管柱分离100～5000 bp DNA片段。Gao等[12]在单色测序分离时，采用浓度为7% 的PVP溶液分离了350 bp的DNA 片段。这类具有高亲水性、良好的溶解能力且能够形成动态涂层的分离介质，虽然可以成功地实现DNA分离，但是由于聚合物溶液的粘度太大[13]，导致了毛细管柱难冲洗。

近年来，纳米颗粒聚合物[14]、二氧化硅纳米颗粒[15]、金纳米颗粒[16] 等作为复合分离介质，已成功用于分离DNA[17]和蛋白质[18]。基于其尺寸效应独特、表面作用位点多、选择性高、生物相容性好等物化性质，这些纳米颗粒分离介质虽可成功分离DNA和蛋白质，但实验过程繁琐，不易制备和使用。亲水性是影响聚合物溶液动态涂层能力和筛分性能的关键因素之一[19]，N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm） 具有亲水的酰胺基团，将其聚合物用于CE，实现了双链DNA和质粒DNA的分离[20]。以NIPAm单体为基质的纳米水凝胶颗粒（Nanoparticles hydrogel， NPs）是一种能在水中显著溶胀，但不能溶解的亲水性聚合物，具有很高的含水量，与生物组织类似，具有良好的生物相容性，近年来，在药物输送与释放[21]、蛋白质识别[22]、医学诊断[23]等生物领域中显示了良好的应用前景。由于NPs内部具有交联网络结构，因此其稳定性高于聚合物胶束、聚合物囊泡等聚合物纳米粒子[24]。

本研究基于NIPAm的亲水性及纳米颗粒的独特优点，设计并合成了一系列以NIPAm为基质的纳米水凝胶颗粒，将其作为毛细管电泳分离介质分离DNA。考虑到在较宽的生理和病理过程范围内，较短的DNA 片段对人类的基因表达具有调节作用[25]，实验选取了20、50和80 nt的DNA片段。通过改变聚合单体和配方，优化分离效果，并探究NPs在DNA分离中的应用可能性以及分离机理。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Zetasizer Nano-ZS动态光散射粒度仪（马尔文（中国）有限公司）; JSM-7500扫描电镜（SEM，荷兰PHILIPS CZECH公司）; 毛细管电泳-激光诱导荧光分析（CE-LIF）仪器装置为实验室自制[26]。熔融石英毛细管（o.d. 365 μm; i.d. 25 μm， 永年县锐沣色谱器件有限公司）。

丙烯酸（AAc，99%）、N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm，99%）、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺（BIS，98%）、三羟甲基氨基甲烷（Tris，99%）、甘氨酸（98%）（北京百灵威科技有限公司）; 丙烯酸羟乙酯（HEAc，99%，阿拉丁试剂有限公司）; 十二烷基硫酸钠（SDS，分析纯，天津市福晨化学试剂厂）; 过硫酸铵（APS，分析纯，北京化工厂）; DNA（T×20、T×50、T×80，99%，生工生物工程有限公司）。实验用水为超纯水（艾科浦纯水系统AWL-0502-U， 重庆台浦有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 纳米水凝胶颗粒的制备 采用乳液聚合法制备纳米水凝胶颗粒[27]。将NIPAm（（95-X） mol%）、 AAc（4 mol%）、 BIS（1 mol%）、 SDS（53 mg）溶于120 mL去離子水中，然后加入HEAc（X mol%），在室温下通N2除氧，磁力搅拌反应120 min; 将反应温度升至70℃，在N2保护下反应40 min; 取APS（83 mg APS溶于12 mL水中）加入上述溶液中，持续通氮气并保持搅拌状态，反应4 h（图1）。将反应后所得聚合物溶液装入透析袋（MWCO≤14000 Da）中透析纯化5天，除去残留的反应物原料和表面活性剂。

2.2.2 毛细管电泳分离DNA实验 截取37 cm、内径为25 μm的未涂层毛细管裸管（从进样口到检测窗口距离30 cm），使用前用0.1 mol/L NaOH冲洗2 h。应用分离电压为+20 kV，电动进样5 s（电压为+15 kV）。运行缓冲溶液为TG溶液（25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，pH 8.3）中加入一定浓度的NPs，样品缓冲溶液为Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH 7.5）。所有的分离都在室温下进行，每次分析后，毛细管依次使用0.02 mol/L NaOH冲洗5 min、水冲洗2 min、缓冲液冲洗5 min。

3 结果与讨论

3.1 纳米水凝胶颗粒的表征

纳米水凝胶颗粒（NPs）采用3种单体NIPAm、HEAc和AAc共聚而成，通过改变配方，制备了一系列NPs，并经DLS检测，获得其粒径、分散性、表面电动势等性质（表1）。

由表1可见，通过改变聚合物配方，获得了粒径和表面电动势均不同的NPs，且HEAc用量越大，表面电动势绝对值越高。所制备的聚合物纳米小球分散指数PDI<0.2，分散性良好。DLS检测结果（图2）表明，NPs粒径分布均匀。

3.2 NPs制备中HEAc用量对DNA分离效果的影响

通常，熔融石英毛细管内壁带负电，在贴近管壁的液体表面会形成一个带正电荷的离子层，将所制备的NPs加入毛细管电泳运行缓冲溶液时，带负电基团的聚合物颗粒可通过静电作用吸附在毛细管内壁上形成吸附涂层，起到抑制电渗流和DNA的吸附作用。在NPs制备中，HEAC单体提供负电荷，由表1可见，控制AAc摩尔百分比不变，HEAc用量从0增加至24%時， NPs表面电动势为负值，绝对值从4.99增加到6.79。

将8.0 mg/mL NPs分别加入到运行缓冲溶液TG中，配制成不同的筛分介质，考察基于不同HEAC用量制备的NPs对3个不同片段DNA的分离效果。如图3所示，采用4种NPs作为复合分离介质加入运行缓冲溶液分离目标DNA，在3 min之内均完成实验。其中，采用NP1、NP3以及NP4的分离效果较差，而采用NP2的运行缓冲溶液对3个DNA片段基本实现了基线分离。这是由于当带负电荷的HEAc摩尔百分比增加时，所制备的NPs电荷斥力增强，带负电基团的NPs表面电动势绝对值越大，通过静电作用在毛细管内壁上形成的吸附涂层越稳定，使得其分离度增大，但是电荷斥力过强，可能导致NPs自身相互排斥，削弱涂层的吸附能力。

3.3 NPs粒径对DNA分离效果的影响

考察了NPs粒径大小对DNA的分离效果。在NPs制备过程中，保持其它条件不变，通过改变SDS用量（5、25和53 mg），制备得到不同粒径的NPs（650、600和480 nm），此结果与文献[28]相符。将这3种NPs分别加入缓冲溶液分离DNA，分离效果如图4所示，可见随着NPs粒径减小， DNA的分离效果有所提高。推测可能是因为粒径小的NPs具有较大的比表面积，且形成了合适的筛分网络结构，对不同的DNA片段产生的阻碍作用不同; 而粒径较大的NPs形成的筛分网络结构不能有效分离不同片段的DNA，而且粒径较大的NPs分散性较差，容易团聚。

3.4运行缓冲溶液中NPs的浓度对DNA分离效果的影响

根据上述优化实验结果，在运行缓冲溶液TG中加入不同浓度的NP2，对3个不同片段DNA的分离效果如图5所示。

由图5A可见，空白实验仅采用运行缓冲溶液TG，不加入任何NPs，此时，3个片段DNA完全无法分离; 通过改变NPs加入量，分离效果有所改善; 当NPs浓度为8.0 mg/mL时（图5C），3个DNA片段实现了基线分离。这是因为以电渗流（EOF）为驱动力的电泳过程分离DNA是根据其大小和形状进行筛分的，因此，具有高亲水性、良好的筛分能力以及动态涂层能力的聚合物水溶液通过吸附在毛细管内壁，形成相对稳定的动力学涂层，可抑制电渗流（EOF）及DNA 片断和毛细管管壁的吸附作用，从而实现对DNA片段的筛分。本研究中，增加聚合物浓度相当于增大了聚合物链网络结构，从而形成了微孔筛分聚合物网络。当NPs浓度较低时，没有形成动态的物理网络结构，分离性能不佳。随着NPs浓度增加，聚合物链网络结构增大，当NPs浓度为8.0 mg/mL时，各片段DNA按大小依次通过筛孔实现分离。当NPs的浓度继续增大时，聚合物链网络结构紧密，形成的筛分孔径减小，增大了DNA的迁移阻力，使得分离度减小。

3.5 NPs分离DNA的作用机理探讨

为了更好地理解NPs作为复合分离介质对DNA分离效果的影响，实验时将NPs灌入毛细管，采用扫描电镜（SEM）观测毛细管中NPs存在形式（图6）。

由图6可见，毛细管内壁吸附了一层或者多层NPs。由于NPs表面具有大量羟基，与毛细管内壁上的硅羟基形成氢键，同时，NPs带负电荷，与管壁正电荷离子层结合。NPs在管壁的吸附，降低了毛细管内壁与DNA间的作用，有效地抑制了DNA 片断在毛细管内壁上的吸附，对毛细管起到了涂层作用。DNA分离过程采用的运行缓冲溶液由TG和亲水性NPs构成，使得NPs在毛细管内壁涂层形成过程动态可逆，动态涂层易于形成和再生，最终实现动态平衡[29]。

近年来，二氧化硅纳米颗粒、金纳米颗粒等已成功用于CE分离DNA和蛋白质，相比这些纳米材料，本研究所制备的纳米水凝胶颗粒易于合成，且不需要作为固定相提前加入毛细管柱，可直接加入缓冲溶液实现分离，操作简单， 不易堵塞毛细管柱。

本研究制备的NPs以温敏性单体NIPAm作为结构框架，因此具有温敏性[30]，在较低临界溶解温度（LCST）下发生相转变。当溶液温度低于LCST时，NPs的亲水部分与水分子间氢键作用占主导地位，凝胶网络外围将形成一种由氢键为主要作用力且高度有序的溶剂壳层，而形成一个相对稳定和网孔大小均一的物理网络结构。当外界温度高于LCST时，凝胶分子的疏水作用加强，形成的疏水层破坏了外围的氢键作用与溶剂壳层，温度升高至LCST时水分子从凝胶中排出，因此发生了由线团到球形结构的构像转变[31]，如图7所示。

当环境温度低于LCST时，NPs发生溶胀，溶液较清澈，高于LCST时，NPs收缩为粒径较小的纳米小球，溶液比较浑浊（图7）。在毛细管聚合物溶液电泳中，DNA的分离性能很大程度上取决于筛分聚合物的物理性质[32]，因此，缓冲溶液中NPs的交联网状结构形成的空间结构与分离效果密切相关。当DNA片段迁移时，核酸分子碰撞进入水凝胶溶液的网络结构中，较大的分子片段只能进入孔径较大的凝胶孔隙内，而较小分子片段可进入较多的凝胶颗粒内。大分子片段在凝胶网络结构中移动的距离较短，较小片段分子的移动距离较长， 当NPs形成了有效的筛分网络结构时，即可对不同片段的DNA实现分离。

4 结 论

采用乳液聚合法，通过调整合成配方，得到一系列具有交联网状结构且粒径均匀可调的纳米水凝胶颗粒，并将其用于毛细管电泳分离DNA。通过考察纳米水凝胶颗粒的单体配比、粒径大小及浓度对DNA分离效果的影响，得到分离DNA的最优配方。实验结果表明，纳米水凝胶颗粒具有高亲水性、良好的筛分性能、稳定性以及生物友好性等优点，浓度低，易于制备和使用，是一种比较理想的筛分介质，在毛细管电泳对DNA及其它生物大分子的分离中具有良好的应用前景。

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