人胎盘间充质干细胞治疗小鼠流产的效果研究

周 平 刘 程 王秋石 朱志清 曹广明 刘崇东 张震宇*

(1.首都医科大学附属北京朝阳医院手术室， 北京 100020；2.首都医科大学附属北京朝阳医院妇产科， 北京 100020)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指孕22周前发生的同一性伴侣连续3次及3次以上的自然流产，在育龄妇女中发生率约1%～3%[1]，有RSA病史的妇女，早产率、胎儿子宫内发育迟缓和新生儿低出生体质量的风险均较一般人群高[2]。因此，RSA不仅危害妇女的身心健康，对其生育的下一代也有不良影响。引起 RSA的病因较多，随着生殖免疫学研究的不断发展，母胎界面局部免疫调节因素异常被认为是RSA的主要原因[3]。间充质干细胞具有强大的免疫调节能力，胎盘提取的间充质干细胞数量众多，质量稳定，已被应用于系统性红斑狼疮等严重免疫性疾病的患者，有效地控制了疾病的进展[4-6]。因此，本研究利用经典高危的流产小鼠模型(CBA/J雌性×DBA/2J雄性)，通过计算胚胎吸收率、胎鼠质量及胎盘质量等观察人胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells, PMSC)治疗RSA小鼠的效果，从而为RSA患者的治疗提供新的治疗方法及治疗思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

1)实验动物：CBA/J雌性×DBA/2J雄性小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2014-0004。6～8周龄清洁级雌性CBA/J小鼠12只，雄性DBA/2J小鼠6只。

2)人胎盘间充质干细胞：购自博雅干细胞公司，为原代培养的第5代细胞，经流式细胞仪检测，CD73、CD90和CD105表达阳性，CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR表达阴性，符合间充质干细胞特性。

3)实验试剂：兔抗鼠单克隆CK8抗体、兔抗鼠多克隆Laminin 抗体购自美国Abcam公司。免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 CBA/J雌性×DBA/2J雄性小鼠模型和人胎盘间充质干细胞移植方法

雌性CBA/J小鼠与雄性DBA/2J小鼠按2∶1比例合笼交配，建立妊娠小鼠模型，小鼠于晚上6点合笼，次日上午8点检查阴栓，检出阴栓者记为妊娠第0.5天；未检出者继续交配，如2 d后未检出阴栓，将雌性小鼠和雄性小鼠分开饲养3 d后再次合笼，如此反复，直至检出阴栓为止。将检出阴栓的小鼠12 只分为对照组和实验组。对照组于孕第1天经尾静脉注射PBS 0.2 mL；实验组于孕第1天经尾静脉注射0.2 mL PBS重悬的1×106个人胎盘间充质干细胞。

1.3 胚胎吸收率计算方法

见栓后13 d处死小鼠，具体方法：麻醉两组小鼠，暴露双侧子宫，观察各组胚胎着床情况，计数胚胎吸收率。胚胎吸收的判定标准：胚胎体积与对照组相比减小，子宫呈“竹节”状，或胚胎完全吸收至未孕状态，胚胎-胎盘单位有明显淤血、组织变性或坏死，上述现象出现其一即判定为胚胎吸收。胚胎吸收率=胚胎吸收数/(胚胎吸收数+胚胎存活数)×100%。

1.4 比较两组胎盘滋养细胞侵润情况

取两组各3只小鼠娩出胎盘组织，每只小鼠留取3个胎盘， 置10%(体积分数)中性甲醛溶液固定24 h以上。常规石蜡包埋、切片，切片厚度为6 μm。石蜡切片常规脱蜡，梯度乙醇水化， PBS液冲洗。采用SP法(二步法)免疫组织化学染色。兔抗鼠单克隆CK8抗体的工作浓度为1∶200、兔抗鼠多克隆Laminin 抗体的工作浓度为1∶250， 操作步骤均按试剂盒说明书要求进行。

分析了来自5只孕鼠的5个胎盘，每个胎盘随机取5个视野进行拍照，借助Image Plus 软件计算和统计分析胎儿血管(fetal blood vessel，FBV)面积和母体血窦(maternal blood sinus，MBS)面积， 同时对浸润到蜕膜组织的CK8阳性滋养细胞的数量进行计数，并测量蜕膜层中CK8阳性滋养细胞与海绵层基线的距离。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组胚胎吸收率比较

实验组共有6只雌鼠妊娠，胚胎存活60个、胚胎吸收5个、胚胎吸收率为8.3%，对照组共有6只雌鼠妊娠，胚胎存活60个、胚胎吸收17个、胚胎吸收率为28.3%，实验组的胚胎吸收率明显高于对照组，差异有统计学意义(χ2=8.01，P=0.005)。各组妊娠子宫形态及胎鼠和胎盘对比见图1。

A：morphology of uterine of pregnant mice of control group;B：morphology of fetus and placenta of control group;C:morphology of uterine of pregnant mice of experimental group；D:morphology of fetus and placenta of control group of experimental group.

2.2 各组胎鼠及胎盘重量比较

实验组胎鼠质量为(1 185.57±87.92)g，胎盘质量为(674.36±66.29)g。对照组的胎鼠质量为(981.57± 118.25)g，胎盘质量为(572.25±89.25)g。实验组的胎鼠及胎盘质量均高于对照组，差异有统计学意义 (P<0.05)，详见表1。

表1 两组胎鼠和胎盘质量比较Tab.1 Comparison of the quality of fetal and placenta

2.3 两组小鼠胎盘迷路层的结构分析

以层黏连蛋白Laminin标记胎儿血管，可见与实验组相比，对照组胎盘中胎儿血管分支明显减少，胎儿血管总面积以及母体血窦总面积均显著降低(图2)。

2.4 滋养层细胞侵润能力的变化比较

用滋养细胞标记分子CK8对胎盘切片进行免疫组织化学染色，对侵润到蜕膜组织的CK8阳性滋养细胞的数量进行计数，实验组明显高于对照组；测量蜕膜层中CK8阳性滋养细胞与海绵层基线的距离，实验组滋养细胞向蜕膜迁移的距离显著远于对照组(图3)。

图2 两组胎儿血管总面积以及母体血窦面积比较Fig.2 Comparison of total area of fetal blood vessel and maternal sinus area

A: Immunohistochemistry results show the distribution of Laminin in placenta of control group;B: Immunohistochemistry results show the distribution of Laminin in placenta of experimental group;C: Fetal blood vessels (red) area and the maternal blood sinus (blue) area were calculated by Image J plus software of control group ;D: Fetal blood vessels (red) area and the maternal blood sinus (blue) area were calculated by Image J plus software of experimental group.E: analysis of lbayrinth layer，**P<0.01.

3 讨论

引起 RSA的病因较多，目前认为RSA的病因包括遗传因素，感染因素、解剖学异常、内分泌因素、免疫功能异常、血栓前状态等，其中近50%的RSA与免疫相关[7]，母胎界面局部免疫调节因素异常被认为是RSA的主要原因[8]。

母体对半同种异体胚胎的免疫耐受是成功妊娠的关键因素，多种免疫细胞，如NK细胞、T细胞、巨噬细胞等以及多种免疫调节因子均参与了母胎界面的局部免疫调节，而任一免疫细胞或免疫调节因子的失衡，均会导致母胎界面的免疫不耐受，而致流产。针对同种免疫型RSA，既往多种免疫治疗方法，如集落刺激因子(granular colony stimulating factor，C-CSF)和丙种球蛋白等均经历了临床实践研究阶段，只在部分患者中取得治疗效果，且经系统评价分析大量数据后发现这些免疫治疗方法并没有降低RSA患者的流产率及提高活产率[9-10]。说明免疫功能异常相关的RSA患者，单一、定向的方法调节某一种细胞或细胞因子，可能不能达到预期的效果。说明RSA的免疫治疗可能需要更深层次或者更全面的免疫功能调节方法。

图3 两组CK8表达阳性的滋养细胞侵润情况比较Fig.3 Comparison of invasion of CK8(+) cells between two groups

A: Immunohistochemistry for Cytokeratin 8 in the placenta of control group;B: Immunohistochemistry for Cytokeratin 8 in the placenta of experimental group;C: Number of Cytokeratin 8-positive cells in the deciudal tissues and distance of cytokeratin positive cells from the base line of spongiotrophoblast region of control group;D: Number of Cytokeratin 8-positive cells in the deciudal tissues and distance of cytokeratin positive cells from the base line of spongiotrophoblast region of experimental group;E: Comparison of invasion of CK8(+) cells，**P<0.01

干细胞作为重要的免疫调节细胞，已被证实可以有效调节免疫功能，在治疗自身免疫系统疾病，如系统性红斑狼疮、硬皮病等，以及抑制移植物抗排异反应方面具有突出效果[4-6]。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。目前的临床应用方向，主要包括器官或组织的修复以及免疫系统功能的调节两方面。作为免疫调节主要应用于促使造血干细胞移植物的植入以及治疗移植物抗宿主病；另外，应用于自身免疫病，如系统性红斑狼疮、硬皮病、类风湿关节炎等，取得了良好的临床治疗效果。

本研究采用CBA/J雌鼠与DBA/2J雄鼠交配制作RSA小鼠模型，已有研究[11-12]经证实该模型雌性小鼠妊娠后，在胚胎着床早期，母体血液系统和母胎界面局部均存在免疫功能异常，包括NK细胞和T细胞异常激活，共刺激因子增加，补体沉积增加，以及和炎性反应相关的淋巴细胞活动增加等[11-12]。因此本研究拟利用该模型，在见栓后对雌性小鼠进行尾静脉注射PMSC，通过PMSC的免疫调节作用，调节雌性小鼠的全身及局部的免疫功能，通过计算各组小鼠的胚胎吸收率以及比较各组胎鼠及胎盘的质量，结果显示PMSC可以增强母鼠的免疫耐受能力，降低免疫系统对胚胎的排斥反应，增加了滋养细胞向子宫蜕膜的侵润能力，显著提高胚胎的着床能力，从而降低胚胎的吸收率。

综上所述，PMSC能够降低RSA小鼠的胚胎吸收率，增加胎鼠及胎盘质量，改善妊娠结局，为实现自然流产的早期预防和治疗提供了新的方向。