多次油苗免疫刺激禽白血病内源性抗体的表达研究

李玉燕 巩新民 祝永华 衣文娟 丁爱君 来庆梅 郭龙宗

摘  要：本试验将200只SPF鸡分为免疫组和非免疫组两组，在4周龄时混入HBD祖代鸡群2个批次，100只/组。将SPF鸡均匀的分布到5个鸡舍，每组每舍20只。免疫组的SPF鸡均按照祖代鸡的免疫程序进行油苗、活苗免疫;非免疫组不进行油苗免疫，仅免疫活苗。分别在9、19、26、30、34周龄采集SPF免疫组和非免疫组的血清，检测ALV-J、ALV-AB的抗体。SPF免疫组和非免疫组ALV抗体的差异显著性分析结果显示：在HBD祖代鸡群ALV-AB和ALV-J亚型抗体水平正常的情况下，随着油苗免疫次数的增加，SPF免疫组和非免疫组在26周龄时的ALV-J和ALV-AB亚型的抗体水平均差异极显著（P<0.001），在19周龄和34周龄均有不同程度的差异。混入的HBD祖代鸡群的种蛋禽白血病（ALV）p27和病原检测均为阴性，不存在水平传播的情况。这说明经多次油苗免疫刺激后，鸡只携带的内源性ALV诱导产生的抗体能被ALV-AB 和ALV-J亚型检测试剂盒所检测到。

关键词：油苗免疫;ALV;抗体表达

中图分类号：S858.312.4     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2019）2-0027-04

禽白血病病毒（Avian leukosis viruses，ALV）属于反转录病毒科、正反转录病毒亚科、α反转录病毒属的一类病毒。该科病毒的基因组是RNA，以具有反转录酶为特征。根据囊膜蛋白gp85的特异性，ALV有A、B、C、D、E、F、G、H、I和J十个亚群，这是依照其发现和鉴定的年代先后确定的。其中最重要的是从鸡群分离到的A～E五个亚群和J亚群。其他几个亚群则是从其它鸟类发现[1]。鸡的ALV分为外源性ALV和内源性ALV两大类。鸡的外源性ALV是指不会通过宿主细胞染色体传递的ALV，包括A、B、C、D和J亚群，致病性强的鸡ALV都属于外源性病毒。内源性ALV是指前病毒cDNA可整合进宿主细胞染色体基因组，因而可通过染色体垂直传播的ALV[2]。目前发现的能产生传染性病毒的内源性ALV都属于E亚群。E亚群内源性ALV虽没有致病性，但它可干扰对外源性感染的检测[3]，给诊断和净化ALV带来了很大的困难。

在“国家白血病净化示范场”创建的认定标准中，白血病抗体曾是主要的指标，要求ALV-AB 和ALV-J亚型抗体为阴性，但在实际鸡群饲养中，总是会发现存在病原分离检测阴性但能检测到抗体的情况。其中徐海鹏、孟凡峰等[3]发表的文章中阐述，某进口祖代鸡场在开产后做常规抽样检测时发现，在一批种鸡中有一定比例的血清样品呈现ALV-A/B亚群抗体阳性，而且种蛋蛋清的ALV-p27抗原检测中也有一定比例阳性。然而，整个鸡群无任何发病表现，产蛋率等也很正常。并且按照常规方法接种DF1细胞和SPF鸡胚来源的鸡胚成纤维细胞（CEF）也未分离到任何病毒。通过对23只种鸡所产种蛋孵化后制备的CEF盲传3代后检测到1株E亚群ALV，并证明其诱导产生的抗体能够干扰对外源性ALV的鉴别诊断。该研究还提出另一问题，为什么这批种鸡会在开产前后有显著比例的个体表达和产生ALV-E，并诱发抗体产生。本研究對这一问题进行了回答，证实在种鸡群开产前经多次油苗免疫刺激下，某些内源性ALV诱导产生的抗体能被ALV-AB和ALV-J亚型检测试剂盒所检测到。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验动物  200只4周龄SPF鸡购自山东益吉达生物科技有限公司。试验种鸡群选用同周龄HBD祖代种鸡群（批次：20161009，20161016），来自山东益生种畜禽股份有限公司。

1.1.2  样品的采集与处理  SPF鸡油苗免疫组和非免疫组分别于9、19、26、30、34周龄同时采集鸡只的血清。用2.5ml注射器从翅静脉采集2ml血液，将注射器置于高于25℃的地方，静置析出血清。

1.1.3  试剂  禽白血病病毒J亚群抗体ELISA检测试剂盒、禽白血病病毒AB亚群抗体ELISA检测试剂盒、禽白血病抗原ELISA检测试剂盒均为美国IDEXX公司产品，批号为：ALV-J：JM660，有效期至2017/11/30;ALV-AB：HM591，有效期至2017/11/18;ALV-Ag（p27）：GM474，有效期至2018/1/7。

1.2  方法  200只SPF鸡分为免疫组和非免疫组，每组各100只。在4周龄时将SPF鸡混入HBD祖代种鸡群2个批次，平均分到5个鸡舍，每舍每组各20只。SPF鸡群免疫组的活苗、油苗免疫按照HBD祖代种鸡群免疫程序进行;非免疫组不免疫油苗，只免疫活苗，活苗全部为进口疫苗，主要是MSD（原英特威）产品。免疫油苗统计：4～9周龄累计免疫油苗4次，4～19周龄累计免疫油苗12次，4～26周龄累计免疫油苗14次，4～34周龄累计免疫油苗14次。分别于9、19、26、30、34周龄采集SPF免疫组和非免疫组的血清，检测ALV-J、ALV-AB抗体。分别于25、26、27、28、36周龄对混入的20161009和20161016批的HBD祖代种鸡群采集血清，检测ALV-J、ALV-AB抗体。在26～28周龄，对开产后20161009和20161016批HBD祖代种鸡群采集190枚种蛋，进行种蛋ALV的p27抗原检测。

2  结果

对SPF油苗免疫组与非免疫组ALV-J、ALV-B的抗体水平，鸡混入HBD祖代鸡群后，4～9周龄，SPF鸡免疫组鸡群共免疫4次油苗，9周龄采集血清检测AB亚群和J亚群ALV抗体，结果显示：SPF鸡免疫组和非免疫组的ALV-AB和ALV-J的抗体水平差异均不显著（P>0.05）;4～19周龄，SPF鸡免疫组鸡群免疫12次油苗，19周龄采集血清的ALV抗体结果显示：SPF鸡免疫组和非免疫组的ALV-AB的抗体水平差异显著（P<0.05），ALV-J的抗体水平差异极显著（P<0.001）;4～26周，SPF鸡免疫组鸡群免疫14次油苗，26周龄采集血清的ALV抗体结果显示：SPF鸡免疫组和非免疫组的ALV-AB和ALV-J的抗体水平均差异极显著（P<0.001）;4～30，SPF鸡免疫组鸡群免疫14次油苗，30周采集血清的ALV抗体结果显示：SPF鸡免疫组和非免疫组的ALV-AB和ALV-J的抗体水平均差异不显著（P>0.05）;4～34周龄时，SPF鸡免疫组鸡群免疫14次油苗，34周龄采集血清的ALV抗体结果显示：SPF鸡免疫组和非免疫组的ALV-AB和ALV-J的抗体水平均差异显著（P<0.05），结果见表1、表2。各周龄SPF鸡免疫组ALV-AB和ALV-J的抗体阳性率均显著高于非免疫组，结果见图1、图2。

2.2  HBD祖代鸡群的ALV-AB、ALV-J的抗体水平  SPF鸡混入的20161009/1016批HBD祖代鸡群，各周龄采集血清的ALV-AB和ALV-J的抗体水平均正常（见表3）。

在26～28周龄，对开产后20161009和20161016批HBD祖代种鸡群采集190枚种蛋，进行ALV的p27抗原检测，检测结果均为阴性。

3  讨论

徐海鹏、孟凡峰等[3]研究发现，某些遗传背景的品系鸡，其基因组中的内源性ALV-E在某种条件诱发下表达量可能会异常提高，也可能干扰对ALV抗体的检测。因此，在一些认为是ALV净化的鸡群，当血清ALV-AB或ALV-J的抗体阳性率显著高于标准时，要结合鸡群临床表现并取血浆或蛋清样品接种DF1细胞进行病毒分离鉴定来做最终判断。目前不建议在禽白血病净化程序中把抗体检测作为一项指标[4]。

鸡细胞基因组某个特定位点含有（稳定地整合）能复制可传染性病毒粒子的E亚群ALV的全基因组，如性染色体Z上的ev21位点，该位点与决定快慢羽相关基因K紧密连锁，ev21可产生传染性病毒EV21。在鸡的基因组上带有ev21等完整的或不完整的ALV-E基因组片段，并不代表就一定会表达，这决定于每一个鸡个体的多种遗传生理因素，甚至同一个体不同生理条件下也不一样。例如，海兰褐祖代的AB系、父母代的公鸡、商品代母鸡中的1/2个体都带有ev21，但一般都不表达p27，或至少表达的量低到检测不出的水平[2]。本实验结果验证，密集的油苗免疫可能会增加白血病内源性因素的表达，而产生非感染性抗体。

随着油苗免疫次数的增加，混入祖代鸡群的SPF鸡群免疫组和非免疫组ALV-AB和ALV-J抗体水平差异显著性分析结果显示：免疫组与非免疫组在26周龄时，SPF鸡免疫组和非免疫組的ALV-AB和ALV-J的抗体水平均差异极显著（P<0.001），在19周龄和34周龄均有不同程度的差异。SPF混入的HBD祖代鸡群2个批次在各周龄采集血清的ALV-AB和ALV-J的抗体水平以及种蛋的p27抗体检测均正常。这说明多次油苗免疫，可刺激某些鸡群的ALV内源性基因的表达，其诱导产生的抗体能被ALV-AB和ALV-J检测试剂盒所检测到。

参考文献：

[1]  崔治中.禽白血病及其防控百问百答（一）[J]. 中国家禽，2016，38（23）：72-76.

[2]  崔治中.中国鸡群病毒性肿瘤病及防控研究[M].北京：中国农业出版社，2013：2-3.

[3]  徐海鹏，孟凡峰，崔治中.种蛋中内源性禽白血病病毒的检测和鉴定[J].畜牧兽医学报，2014，45（8）：1317-1323.

[4]  崔治中.禽白血病及其防控百问百答（五）[J]. 中国家禽，2017，39（3）：73-76.