基于GenBank数据对红柴胡nrDNA序列ITS2片段的分析

王鹤 杨娜 徐丹丹 等

摘要 [目的]了解红柴胡nrDNA序列ITS2片段特征，为中药柴胡的分子鉴定提供科学依据。 [方法]从GenBank中获取已公布红柴胡ITS全长序列38条和ITS2序列3条，利用MEGA6.0 进行多序列比对，分析ITS2片段碱基成分、变异位点、信息位点，计算遗传距离，并用邻接法（NJ）构建系统聚类树。[结果]ITS2片段长度为224～230 bp，共发现14个简约信息位点，最大遗传距离0.124，系统树可明显分为4组，85.37%的聚为一组。[结论]ITS2在红柴胡居群中比较保守，可作为DNA barcoding鉴定的片段使用。

关键词 红柴胡;ITS2;遗传距离;发育分析

中图分类号 S188文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）04-0114-03

Abstract [Objective]Sequence character of nrDNA ITS2 fragment in Bupleurum scorzonerifolium Willd. was analyzed to provide scientific evidence in identification of traditional Chinese medicinal herb chaihu.[Method]Fortyone sequences including thirtyeight full length ITS and three ITS2 fragments were downloaded from GenBank.Nucleotide composition，variable sites，parsimony informative sites were analyzed after alignment in MEGA6.0.Meanwhile，the genetic distances were computed using Kimura2parameter （K2P） model and phylogenetic tree was constructed using the neighborjoining （NJ） method.[Result]The length of ITS2 varied from 224 bp to 230 bp including 14 parsimony informative sites，and the maximum K2P distance was 0.124.Four clades were grouped in NJ tree among which 85.37% sequences clustered in clade IV.[Conclusion]ITS2 is an ideal sequence in chaihu identification for its conservatism among B.scorzonerifolium populations.

Key words Bupleurum scorzonerifolium Willd.;ITS2;Genetic distance;Phylogenetic analysis

红柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）是《中国药典》收录的中药柴胡的2种基源植物之一，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气功效[1]。红柴胡广布于我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、山西、陕西、江苏、安徽、广西及内蒙古、甘肃诸省区，在俄罗斯远东、蒙古、朝鲜至日本也有分布[2]。虽然柴胡属的多数种类在国内各地均作为药材收购使用，但药性的差异仍不容忽视，因此，对红柴胡基源植物的准确鉴定依然是值得关注的问题。

核糖体内转录间隔区序列（internal translation spacer，ITS） 由于所受选择压力小、碱基替换较快、协同进化，且具有拷贝数大等特点，在植物种质资源鉴定、系统演化、遗传多样性等研究中被广泛应用[3-5]。ITS2 片段是位于5.8S 序列和 28S序列之间的nrDNA间隔区，片段短且易扩增、测序，变异位点能够保证其鉴定能力及鉴定的成功率，其具有良好的通用性，在多个科属基源植物及药材的鉴定中已得到了验证，被认为是最适合作为DNA 条形码的片段[6-10]。笔者基于GenBank数据对红柴胡nrDNA序列ITS2片段进行分析，以期为中药柴胡的分子鉴定提供科学依据。

1 研究方法

1.1 数据来源

从GenBank中下载已公布的所有红柴胡ITS全长序列38条和ITS2序列3条，与柴胡属标准ITS2序列对比，确定共计41条ITS2序列长度边界后作为该研究的DNA序列。

1.2 数据处理

首先，将序列导入MegAlign （Lasergene7.1）[11]，另存成.fas文件后，将所有序列用软件MEGA6.0[12]进行多序列比对，分析ITS2序列碱基成分、变异位点、信息位点，利用Kimuras双参数模型计算遗传距离，并用邻接法（NJ）构建系统聚类树，Bootstrap设置1 000 次重复检验各分支的支持率。

2 结果与分析

2.1 序列特征与ITS2多态性

红柴胡的ITS2序列長度为224～230 bp，比对后长度为230 bp，含3处插入/缺失。 其中，KF573806长度为224 bp，AY551294长度为226 bp，其余39条序列均为230 bp，平均为229.8 bp，长度变异较小。GC含量占总核苷酸碱基的60.3%。共检测到32个变异位点，单变异位点18个，简约信息位点14个（表1）。

2.2 遗传距离