慢病毒介导PNX沉默细胞株的构建与鉴定

丁毅飞 曹春雨 王凭青

摘要[目的]构建慢病毒介导的PNX沉默载体，感染GnRH分泌细胞（GT1-7）后进行筛选鉴定，获得稳定的PNX沉默细胞株。[方法]结合RNAi干扰技术构建出慢病毒沉默载体，在293T细胞中包装病毒并测定滴度。感染GnRH分泌细胞（GT1-7），嘌呤霉素筛选得到稳定细胞后利用Real-time PCR和Western blot检测PNX沉默效果。[结果]慢病毒介导的PNX沉默载体构建成功，包装的慢病毒成功感染GT1-7细胞，并且Real-time PCR和Western blot证实了PNX沉默细胞株的PNX沉默效果。[结论]成功构建了慢病毒介导的PNX沉默细胞株，为以后探索PNX对动物生殖发育的作用打下了基础。

关键词慢病毒;PNX;生殖

中图分类号S852文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）02-0094-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.027

动物复杂而精密的生殖发育过程由中枢神经系统与内分泌系统共同调控，下丘脑中众多生殖相关的神经肽信号汇聚于GnRH（Gonadotropinreleasing hormone，GnRH）神经元上，并与下丘脑-垂体-性腺（hypothalamicpituitarygonadal，HPG）轴中的各种生殖相关因子共同调控动物生殖发育过程[1]。PNX是在2013年利用生物信息学技术所发现的一个新的生殖相关肽，并且检测到其在下丘脑及外周组织处广泛表达，在下丘脑中的表达最高[2]。研究发现PNX可以通过结合受体GPR173调控下丘脑、垂体细胞系中某些生殖相关基因[3-4]，研究也发现PNX参与了成年大鼠发情期的调控 [2，4]，但是PNX参与生殖的调控方式仍然有许多未知的机制。笔者结合慢病毒载体以及RNAi干扰2种技术来构建慢病毒介导的PNX沉默载体，对GnRH分泌细胞系（GT1-7）进行慢病毒感染并筛选出稳定的PNX沉默细胞株，以期为进一步探索PNX在分子以及模型动物层面的生殖调控机制打下基础。

1材料与方法

1.1主要材料和试剂

慢病毒pCDH-CMV-GFP-Puro与其辅助质粒以及限制性内切酶等购买于武汉优宝生物科技有限公司;慢病毒干扰序列与对照序列由重庆擎科合成;小鼠GnRH分泌细胞系（GT1-7）由美国加利福利亚大学Pamela Mellon教授提供;人胚肾293T细胞购买于上海中科院细胞所;质粒 DNA 提取试剂盒、切胶回收试剂盒、细胞瓶/板等购买自北京鼎国昌盛生物科技有限公司;抗PNX多克隆抗体（Bioss），HRP标记二抗（Proteintech），细胞用高糖培养基、血清、大肠杆菌（DH5α）等均购自Gibco公司。

1.2方法

1.2.1构建慢病毒介导的PNX沉默载体。

用BamHI与EcoRI 2种内切酶对pCDH-CMV-GFP-Puro载体进行双酶切，利用切胶回收试剂盒对目的片段进行回收。对Sigma公司已验证的PNX干扰序列及对照序列合成后，分别进行退火得到双链，接着与回收的目的片段在T4连接酶作用下进行连接，将连接产物转入大肠杆菌（DH5α），将用氨苄培养基筛选得到的阳性菌落挑出送给生物公司测序，将测序成功所获得的质粒命名为shPNX和shCON。

1.2.2病毒合成与滴度测定。

将重组质粒shPNX和shCON分别与2种包装质粒（PMD2G，pSPAX）按照1∶3∶4的比例共转染293T细胞，转染8 h后更换完全培养基培养48 h收获1次病毒，换新的培养基后24 h再收获1次病毒，将2次病毒合并，利用0.45 μm滤器过滤浓缩病毒后分装于-80 ℃保存。

在24孔板中接种293T细胞，将获得的干扰及对照病毒稀释成不同浓度对293T细胞进行感染24 h，换完全培养基培养96 h后观察各个组别GFP荧光差异，计算病毒滴度。

1.2.3慢病毒感染GT1-7及稳定细胞株筛选。在6孔板中接种GT1-7细胞至其生长至40%左右，用收获的shPNX及shCON慢病毒对细胞进行感染24 h，之后与6孔板中不加慢病毒的阴性对照CON组细胞一起正常换液培养至72 h。

在荧光显微镜下观察到GFP绿色荧光后利用之前实验室已优化的1 μg/mL的puromycin筛选条件对各组GT1-7细胞进行筛选，每天利用含有1 μg/mL puromycin的新鲜培养基换液直到阴性对照CON组细胞全部死亡，即得到shPNX及shCON稳定细胞株，观察GFP荧光后进行扩大培养。

1.2.4Real-time PCR检测PNX沉默效果。

在12孔板中分别接种3组细胞（GT1-7，GT1-7-shCON，GT1-7-shPNX）各3孔，待细胞汇聚度在80%左右，利用试剂盒提取RNA然后进行反转及定量PCR检测，以β-Actin作为内参进行分析。PNX定量引物为F：5′-GCGCTCATATTCGGAGGCTT-3′，R： 5′-ACCACACTTTCAACCCTGGC-3′，β-Actin定量引物为F： 5′-ACTCCTATGTGGGTGACGAGG-3′，R：5′-CACACGCAGCTCATTGTAGAAG-3′。

1.2.5Western blot技术检测PNX沉默效果。

在6孔板中分别接种3组细胞（GT1-7，GT1-7-shCON，GT1-7-shPNX）各3孔，待细胞汇聚度在80%左右，利用RIPA裂解液在冰上裂解细胞后，离心取上清蛋白液，利用BCA試剂盒进行定量处理后，对蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，随后用一抗结合4 ℃冰箱过夜，用TBST洗膜3次，再用二抗室温结合1 h后再次洗膜3次，最后在暗室进行显影。用β-Actin蛋白作为内参。

1.2.6統计分析。

3次独立重复试验，数据采用软件SPSS 20进行处理分析，数据结果以均数±标准差表示，利用单因素方差检验对多组数据的均数差异进行检验，组间采用独立t检验，P<0.05被认为具有统计学意义。

2结果与分析

2.1构建shPNX和shCON载体及测序

构建shPNX和shCON载体后送往生物公司进行测序，通过DNA-MAN软件分析后，提示成功将目的序列插入了慢病毒载体，载体构建成功。

2.2慢病毒包装及滴度测定

shPNX和shCON慢病毒包装后分别进行滴度测定，得到shPNX慢病毒滴度为2.2×108 TU/mL，shCON慢病毒滴度为2.5×108 TU/mL。

2.3慢病毒感染GT1-7及稳定细胞株筛选

利用shPNX和shCON慢病毒感染GT1-7后，用puromycin筛选获得了稳定的慢病毒感染细胞株（图1）。

2.4PNX mRNA的表达水平

shPNX组的PNX mRNA表达量（0.297）显著低于shCON组（1.167）及阴性对照组（1.000），差异具有显著性（P<0.01）。

2.5PNX的蛋白表达水平

shPNX组的PNX 蛋白表达量显著低于shCON组及阴性对照组，差异具有显著性（P<0.01，图2）。

3讨论

在研究中构建了慢病毒介导的PNX干扰载体，在感染GnRH分泌细胞株GT1-7后筛选得到了稳定的PNX沉默细胞株，并且检测到显著的PNX沉默效果。动物的生殖发育调控由体外环境与体内环境共同影响，由多种因子共同调控，PNX作为一个新发现的生殖肽，不仅在生殖方面存在调控作用[5-7]，还在感官处理、记忆、焦虑处理[8-10]等方面有调控作用。此次试验所构建的慢病毒介导的PNX干扰载体以及PNX沉默的GnRH分泌细胞株，可以进一步用于探索PNX与GnRH等生殖相关肽的调控关系，也可以为以后进一步探索PNX在模式动物中的生殖调控及其他生物学作用打下基础。

参考文献

[1] ABREU A P，KAISER U B.Pubertal development and regulation[J].Lancet diabetes & endocrinology，2016，4（3）：254-264.

[2] YOSTEN G L C，LYU R M，HSUEH A J W，et al.A novel reproductive peptide，phoenixin[J].Journal of neuroendocrinology，2013，25（2）：206-215.

[3] TREEN A K，LUO V，BELSHAM D D.Phoenixin activates immortalized GnRH and kisspeptin neurons through the novel receptor GPR173[J].Molecular endocrinology，2016，30（8）：872-888.

[4] STEIN L M，TULLOCK C W，MATHEWS S K，et al.Hypothalamic action of phoenixin to control reproductive hormone secretion in females：Importance of the orphan G proteincoupled receptor Gpr173[J].American journal of physiology：Regulatory，integrative and comparative physiology，2016，311（3）：489-496.

[5] YUAN T Y，SUN Z X，ZHAO W Q，et al.Phoenixin：A newly discovered peptide with multi-functions[J].Protein & peptide letters，2017，24（6）：472-475.

[6] WANG M，CHEN H P，ZHAI Y，et al.Phoenixin：Expression at different ovarian development stages and effects on genes ralated to reproduction in spotted scat，Scatophagus argus[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2019，228：17-25.

[7] WANG M，DENG S P，CHEN H P，et al.Phoenixin participated in regulation of food intake and growth in spotted scat， Scatophagus argus[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2018，226：36-44.

[8] LYU R M，HUANG X F，ZHANG Y，et al.Phoenixin： A novel peptide in rodent sensory ganglia[J].Neuroscience，2013，250（8）：622-631.

[9] JIANG J H，HE Z，PENG Y L，et al.Effects of Phoenixin-14 on anxiolytic-like behavior in mice[J].Behavioural brain research，2015，286：39-48.

[10] JIANG J H，HE Z，PENG Y L，et al.Phoenixin-14 enhances memory and mitigates memory impairment induced by Aβ1-42 and scopolamine in mice[J].Brain research，2015，1629：298-308.