棉花黄萎病生物防治研究进展

徐娅 谢成建 杨星勇

摘要棉花黄萎病是由对寄主有强致病力和优势适应性的大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的土传性真菌病害，严重影响我国棉花生产可持续发展。生物防治在防治土传病害方面，具有独特的优势，不仅能够减轻病害发生，而且对环境安全、无污染。该研究将从植物提取物、抗生素、细胞壁降解酶、拮抗微生物（真菌、细菌、放线菌）等几个方面论述黄萎病生物防治方面的研究进展;同时，还指出棉花黄萎病生物防治存在的问题，并对今后的发展趋势进行展望，以期为棉花黄萎病的防治提供参考。

关键词棉花;黄萎病;生物防治

中图分类号S476文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）02-0018-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.006

棉花是纺织工业中重要的天然纤维作物，是许多发展中国家的经济支柱。棉花黄萎病是由黄萎病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的世界范围内的土传性病害，1914年首次在美国弗吉尼亚州被报道，随后蔓延到包括中国在内的数十个国家和地区[1-3]，对棉花产量造成巨大损失，棉花黄萎病成为棉花高产稳产的主要障碍[4-5]。

棉花黄萎病的主要防治方法是培育抗病品种，但由于缺乏有效的抗病源，目前尚无成功栽培的高抗病品种。化学防治没有有效的杀菌剂，容易造成环境污染;在生物防治方面已经有很多微生物被证实具有生防效果，有的已逐步走向应用[6]。许多生防微生物可产生多种抗生素、胞外酶等活性物质，加之孢子抗逆性强，在土传病害防治方面具有较好的应用前景，目前主要集中研究生防微生物对黄萎病菌的生防机理、防病促生效果，以及生物防治微生物与黄萎病菌和棉花植物之间的相互作用机制，为控制棉花黄萎病提供高效、多功能的生防微生物，为生物菌活菌制剂的实际应用提供理论依据。

1植物提取物

植物提取是根据提取的最终产品的需要使用植物作为原料的物理化学提取和分离过程。植物提取物是指在植物中定向获取和浓缩1种或多种活性成分而不改变其活性成分结构而形成的产物，目前枸杞（Lycii Fructus）、茯苓（Poria）、五味子（Schisandra chinensis）的抗氧化作用均已得到試验证明[7]，植物提取物清除自由基的机理和环保型杀虫剂的发展为寻找新型抗真菌物质提供了借鉴。为了验证各种植物提取物是否具有抗大丽轮枝菌的作用，一些研究者进行尝试，并有多种植物源活性成分的农药取得登记并成功应用。Khaskheli等[8]通过体外试验筛选了26种抗菌药用植物，均能降低大丽轮枝菌的菌落生长速率，具有杀菌潜力，其中，梅花（Prunus mume）和漆树（Rhus verniciflua）提取物的抗菌效果最强，其次是黄连（Coptis chinensis）、黄柏（Cortex phellodendri）和姜黄（Curcuma longa）。最近姜岚等[9]对56种中药提取物的抑菌活性及防治效果进行筛选和鉴定，其中有26种在质量浓度为10 g/L时对大丽轮枝菌的菌丝生长抑制率达50%以上，五味子提取物可有效抑制大丽轮枝菌引起的棉花维管束褐化症状，提高黄萎病的防治效果，并缓解发病程度。国内学者Wang等[10]研究天麻（gastrodia elata），发现它含有4种抗真菌蛋白GAFP，GAFP对包括黄萎病在内的各种真菌具有良好的抗性。其中GAFP4具有较强的抗菌活性，进一步将GAFP4基因转到陆地棉品种中，发现GAFP4对不同生理类型的黄萎病菌株具有非常明显的抗性，预示其在植物抗真菌病基因工程中具有广阔的应用前景。

2抗生素

抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中产生的一类次级代谢产物，对病原体具有抗性，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。拮抗微生物抑制大丽轮枝菌，主要是通过向胞外分泌能降解细胞壁、抑制生物合成与能量代谢系统的高活性抑菌物质，包括小分子抗生素、大分子拮抗蛋白多肽和细菌素等[11-13]。目前，脂肽类抗生素、表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturins）和丰原素（Fengycin）报道较多[14-16]。表面活性素分为 3 种类型：Surfactin A、B和C，它具有亲水性头部和亲脂性尾部的特定结构，具有阻碍中间纤维的合成、嵌入磷脂双层以增加质膜的渗透性和阻碍腺苷-3'，5'-环化一磷酸（Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP）合成等功能。一些芽孢杆菌（Bacillus）通过产生表面活性素来诱导宿主产生系统抗性[17]。伊枯草菌素具有很强的拮抗真菌的能力，伊枯草菌素是通过使病菌磷脂双层的电导率增加、质膜成孔率提高和渗透性增加而抗菌。如分离的内生真菌解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）41B-1菌株对棉花黄萎病具有50%以上的生物防治效果，其培养滤液中存在抗真菌化合物伊枯草菌素，能抑制大丽轮枝菌微菌核的形成，诱导氧化应激和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）等，影响真菌信号传导途径，并介导植物对大丽轮枝菌的防御反应[18]。丰原素由fenA、B、C、D和E相关基因簇合成，对丝状霉菌的拮抗能力很强[19]。Vanittanakom等[20]发现枯草芽胞杆菌（B.subtilis）F-29-3能产生抗真菌脂肽复合物丰原素，它能抑制丝状真菌。

3细胞壁降解酶类

真菌细胞壁的主要成分是几丁质和β-1，3-葡聚糖。几丁质酶可以降解病原真菌细胞壁中的几丁质[21]，破坏细胞新物质沉积，导致病原体死亡;同时，降解的细胞壁片段具有诱导作用，能刺激宿主植物的抗病反应。植物几丁质酶在体内表达定位的不同也导致其抗菌特异性[22]，这是由于成熟真菌菌丝顶部的几丁质酶层外层中存在β-1，3葡聚糖、类脂层等，几丁质酶与β-1，3葡聚糖酶可通过抑制病原菌的孢子萌发和菌丝生长而起到防御作用[23]。近年来，许多植物中的几丁质酶基因被克隆，已成为抗真菌基因工程研究的热点之一[24-26]。植物可以分泌几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶，生防微生物也可以合成和分泌几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶，β-1，3-葡聚糖酶可降解大丽轮枝菌菌丝体的细胞壁，导致细胞壁压力降低，菌丝体的顶端细胞破裂，内容物外泄，致使细胞死亡，进而诱导植物的抗病防卫反应;当葡聚糖酶与几丁质酶相互作用时，抗菌作用更强[24]。Zhu等[27]通过构建表达了PevD1的大肠杆菌，发现浓度低至4 μg/mL时浸种能够改善棉花的抗性，接种后第15天病害发生率降为38.16%。

4拮抗真菌

对棉花黄萎病有防效的真菌种类较多，目前研究较多的是木霉（Trichoderma spp.）和黄色蠕形霉（Talaromyces flavus）[28]， 同时，还有一些内生真菌也具有拮抗黄萎病菌的作用。

木霉属用于防治病害的主要机制可分为5类，即产生抗生素、营养竞争、微寄生、细胞壁分解酵素以及植物抗性的诱导。目前诱导抗性只有在少数木霉菌株中出现。张海军等[29]分别从棉田筛选出3株拮抗黄萎病的木霉菌株、木霉GY20菌株，对棉花黄萎病的防效显著。宋晓妍等[30]筛选到一株木霉SMF菌株，它可分泌多种细胞壁降解酶，抑制大丽轮枝菌的生长。Bot等[31]通过土壤稀释法分离出30种来自土壤的真菌和23种来自棉花植株的真菌，包括绿色木霉（T.viride）、康氏木霉（T.koningiopsis）、深绿木霉（T.atroviride）等，体外试验表明它们对大丽轮枝菌表现出很强的抗性。孟娜等[32]分离并筛选到4株木霉，这些木霉菌丝在棉花黄萎病菌丝上平行或波浪式生长，且棉花黄萎病菌丝出现细胞原生质浓缩和菌丝断裂等现象。

黄色蠕形霉是一种土居性真菌，分布广泛，能在植物根际土壤及根部繁衍[33]，该真菌的主要抗病机制是抑菌和重寄生，同时，还产生过氧化氢杀死大丽轮枝菌的微菌核。Fahima 等[33]发现黄色蠕形霉菌丝可以侵入到大丽轮枝菌的微菌核中，其分泌的代谢物可以在体外和土壤中杀死病菌的微菌核，并且抑制菌丝生长。韦善君等[34]发现黄色蠕形霉对大丽轮枝菌、刺盘孢菌（colletotrichum spp.）的菌丝生长及分生孢子萌发和棉立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、棉枯萎尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的菌丝生长具有明显的抑制作用。

目前，已有许多人研究利用植物上的内生真菌控制植物病害。如苦参（Sophora flavescens）的一种内生真菌土曲霉（Aspergillus terreus）对25种植物病原真菌和14种常见的内生细菌有拮抗作用[35]。张芸等[36]从棉花中分离出200株棉花内生真菌，筛选出3株球毛壳菌（Chaetomium globosum）CEF-082、枝顶孢（Acremonium strictum）CEF193和镰刀菌属（Fusarium sp.）CEF-559，对黄萎病菌生长有较强的抑制作用，对棉花黄萎病的防治效果60%以上。徐莉莉[37]发现尖孢镰孢（F.oxysporum） By125和丛赤壳属（Nectria haematococca） Bx247能有效地防治黄萎病。Li等[38]在棉花上分离出642株真菌，并从中筛选出7株对棉花黄萎病病菌抑菌作用较高的菌株，小球腔霉属（Leptosphaeria sp.）CEF-714、黄色蠕形霉CEF-642、赤霉菌（Gibberella intermedia）CEF-026、枝顶孢CEF-193、镰刀菌属CEF-325、简青酶（Penicillium simplicissimum）CEF-818和子囊菌（Ascomycete sp.）CEF-109。Yuan等[39]进一步研究发现，CEF-818和CET-714菌株处理棉花，可以增加棉花苯丙氨酸酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物（POD）的转录水平，导致棉花防御反应增强。Zhu等[27]从棉花中分离出大丽轮枝菌CVd-WHw和变黑轮枝菌（Gibellulopsis nigrescens） CVn-WHg，其棉花植株的致病性显著低于大丽轮枝菌CVd-AYb;CVn-WHg和CVd-WHw能对已经接种了CVd-AYb的棉花提供交叉保护;其后，Vagelas等[40]证明变黑轮枝菌对由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病具有交叉保护。用无毒或减毒菌株感染棉花植物以诱导系统抗性或交叉保护也是控制黄萎病的重要方法;花椰菜（Brassica oleracea）上的一种弱毒大丽轮枝菌Vt305对西兰花黄萎病具有抗性[41]，将分离的黄萎病菌CVd-WHw弱毒菌株接种到棉花上[42]，可显著降低强毒力菌株对棉花的感染。

最近，有研究报道，绿僵菌（Metarhizium anisopliae）和白僵菌（Beauveria bassiana）产生的次生代谢产物可以抑制大丽轮枝菌的孢子萌发、菌丝体生长和微菌核形成[39]。Zhang等[43]通过GC-MS鉴定非致病性尖孢镰孢CanR-46产生的挥发性有机化合物（VOC），发现 Fo-VOC具有抗真菌活性，进一步用 Fo-VOC熏蒸污染了大丽轮枝菌的土壤，发现 Fo-VOC能抑制大丽轮枝菌菌丝生长，延迟分生孢子萌发，抑制胚芽管的伸长，并导致菌丝发生皱缩和降解。Lan等[44]从中国陕西秦岭土壤中分离出具有广谱抗真菌活性的淡紫紫霉属（Purpureocillium lilacinum） QLP12，发现其对体外真菌菌丝体生长具有较高的抑制活性，对黄萎病具有显著的防治效果。

5拮抗细菌

拮抗棉花黄萎病的细菌主要有芽孢杆菌、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、枯草芽胞杆菌和伯克霍尔德氏菌（Burkholderia spp.）[45]，研究较多的是解淀粉芽孢杆菌和枯草芽胞杆菌[46]，它们不仅拮抗植物病原，而且具有强大的生命力，高定殖率和一定的促生长作用，因此，受到各国研究人员的青睐。

芽孢桿菌的生物防治作用主要在于其诱导植物抗病性、竞争和拮抗作用。竞争作用主要是营养和空间位点的竞争，芽孢杆菌因为抗逆性强，能够在土壤、植株体表和体内大量繁殖和定殖，进而阻止和干扰黄萎病菌在棉花上的定殖和侵染。营养竞争只在少数菌株中发现。陈英化等[47]从棉花中筛选到的内生菌解淀粉芽孢杆菌 L-4-2，不仅定殖能力强，而且对棉花黄萎病有较好的防治效果。Tehrani等[48]从土壤中分离到高效拮抗黄萎病菌的假单胞杆菌2株、芽孢杆菌2株，其菌剂应用于大田防治棉花黄萎病获得较好的防效，且棉花的产量也获得不同程度的提高。此外，还从棉花中分离到解木聚糖类芽孢杆菌（Paenibacillus xylanilyticus）YUPP-1[49]、多粘类芽孢杆菌（P.polymyxa）YUPP-8、枯草芽孢杆菌YUPP-2，其定殖棉株后，棉花苗期黃萎病感染率大大降低。拮抗作用主要通过产生抗菌物质来抑制病原的生长或直接杀死病原体，李术娜等[50]以及Stein[51]和 Latha等[52]报道表明，芽孢杆菌可以产生多种抑制植物病原体生长的生物活性因子，如细菌素、几丁质酶、抗菌肽和酚类。细菌素属于抗菌肽类型，具有强碱性、热稳定性好和广谱抗菌等特点[53];酶类及蛋白抑菌机制主要包括抑制病原菌孢子产生和萌发，使病原菌细胞壁溶解和原生质泄露。新抗菌蛋白的获得为抗菌基因的克隆和转抗菌蛋白基因植物的研究奠定了理论和实践基础。王奕丁等[54]研究发现，芽孢杆菌ZL2-70抗菌蛋白抑菌谱广，理化性质稳定，初步推断该抗菌蛋白通过多糖酶活力破坏大丽轮枝菌的细胞壁和抑制病原菌的孢子萌发而起到抑菌作用，赵君洁[55]通过质谱鉴定和平板试验发现，枯草芽孢杆菌J-15抑菌物质通过抑制孢子萌发，菌丝伸长，造成大丽轮枝菌的抗氧化系统和膜系统的损伤来防治棉花黄萎病。聂太礼[56]、田绍仁等[57]分离的芽孢杆菌C-02菌株分泌的抗菌蛋白可以溶解病原体大丽轮枝菌VD-11的细胞壁，抑制其致萎毒素的分泌，并提高防御酶活性，具有较好的棉花黄萎病防治效果。李社增等[58]从棉花中分离到一株枯草芽孢杆菌NCD-2菌株，其分泌的胞外抗菌物质能够抑制大丽轮枝菌的生长，该菌株已被开发为控制棉花黄萎病的微生物农药[59]，并于2015年正式注册。此外，还有4株枯草芽孢杆菌（EB03，MB1600，QST713和FZB2）已获得环境保护局（EPA）的许可[60]，用于商业化生产。

诱导植物抗病性主要是诱导病程相关蛋白PRP的产生和相关防御酶活性的增强，寄主防御酶主要包括PAL、POD、PPO。蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）YUPP-10[61]通过直接抑制病原菌的生长，同时诱导植物防御反应来抑制病原菌的侵染和扩展，具有良好的应用前景，Erdogan等[62]发现假单胞菌、沙雷氏（Serratia）也有助于黄萎病的防治，并改善棉田的生长参数，但对其防治机制尚不清楚。另外，功能性微生物群和微生态有机肥的结合可以显著降低棉花根际土壤中的黄萎病菌数量，控制棉花黄萎病的效果明显[63]。目前关于荧光假单胞菌的研究相对较少，Prieto等[64]从橄榄根中分离出一株荧光假单胞菌PICF7菌株，它具有拮抗体外黄萎病菌的作用;通过对PICF7菌株全基因组序列的测定和基因组分析表明[65]，分泌系统、铁载体、解毒化合物或挥发性成分合成等功能基因对拮抗黄萎病菌具有重要作用;其进一步研究将有助于深入了解生防微生物在宿主组织中的定殖过程、与根内生菌的相互作用以及控制病害发生的分子机制。

安徽农业科学2019年

6拮抗放线菌

放线菌在棉花黃萎病的生物防治中起着十分重要的作用。目前，应用广泛的主要放线菌是5406，其菌粉拌种或浸种能很好地防治棉花黄萎病[66]。研究者分别从土壤、棉花根部或棉花植株内分离到多种放线菌用于棉花黃萎病的控制。王兰英等[67]从土壤中分离筛选出28株放线菌，并通过抑菌圈试验筛选出4株具有较强拮抗作用的菌株，它们的发酵原液对大丽轮枝菌的拮抗作用明显强于发酵滤液和菌丝体提取物。Xue等[68]分离并筛选了4株拮抗黄萎病菌株链霉菌（Streptomyces），其分泌的真菌细胞壁降解酶和蛋白酶能导致黄萎病菌生长被阻断甚至死亡;4株菌都具有较强的定殖能力，防治率达到18.7%～65.8%。刘大群等[69]从土壤中分离的27株链霉菌菌株中筛选出3株高效拮抗大丽轮枝菌的菌株，其分泌物可使黄萎病菌菌丝膨大破裂。Cao等[70]从患病棉花的根中分离的内生放线菌菌株 DHV3-2，其受感染棉花的根中具有较高的根定殖能力。它对大丽轮枝菌和其他致病真菌有较强的抑制作用。

7生防微生物防治效果的影响因素

生防微生物防治效果的影响因素主要是生防微生物的定殖效率，土质、土壤温度、土壤容重和盐碱度等，生防微生物定殖效率是决定防治效果的首要因素 ，土壤温度是生防微生物定殖的决定性因素。 通过向生防微生物中添加一系列的微量元素（ Fe2+、Zn2+、Mg2+等）和有机质[71]，可以显著提高生防微生物的生物防治效果和抗病能力。此外，微生物对碳源和氮源的利用率、根际土壤中营养竞争的优势等因素对生防效果有一定的影响。如果生防微生物不能在根际土壤中成功定殖，那么所有其他抑菌机制都没有真正的生防价值[72]。

8展望

生物防治的优势在于多抗性、持久性、整体性。诱导抗病是非特异性的、不稳定的，同时对人畜无害，可以最大程度地降低农药的使用，减轻农药的环境污染，目前已经筛选出一些具有较好防病效果的微生物，但仍然存在一些限制因子，如：①大多数生防微生物与植物之间的营养竞争，导致植物从生殖中转移能量，使得植物的产量不比健康植株高，但是也有一些微生物如枯草芽孢杆菌4-2、Muc-7[73]能促进棉花幼苗的生长，但是它是否能够提高棉产量还有待进一步证实。②会导致次生代谢产物的积累，对植物细胞造成毒害。③可能会导致病害流行。④理想的生防微生物较少。生防机制还存在许多空白有待深入揭示，一些生防微生物制剂开发较慢，效果也有待提高。针对以上问题，今后应加强生防微生物筛选、生防机制、生防效果稳定性等研究，将生物防治与遗传学、栽培学、分子生物学和生态学方法相结合，以明确防病机理，加快抗性品种和基因的筛选，应用时注重其他防治方法与生物防治的结合，取长补短，相互协调，从而寻求真正高效、绿色、性能稳定的综合防治方法。

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