灰色链霉菌LD1810产胰蛋白酶发酵条件的优化

王兴吉 王克芬 刘文龙 郭庆亮

摘要胰蛋白酶（Trypsin）作用于碱性氨基酸精氨酸及赖氨酸羧基所组成的肽键，被广泛用于食品、医药和皮革等工业领域。该文研究高产诱变灰色链霉菌LD1810产胰蛋白酶（SGT）的最优发酵培养基，探讨SGT的最佳发酵条件，为SGT的商业化生产提供技术参考。通过单因素试验和L9（34）正交试验确定发酵培养基的最佳组分：葡萄糖 20 g/L，大豆粉 40 g/L，KH2PO4 2.5 g/L，CaCl2 1 g/L。最适发酵条件为发酵温度28 ℃，初始pH 8.0，300 mL 三角瓶的装液量100 mL，摇床转速 240 r/min。

关键词灰色链霉菌;胰蛋白酶;培養基;发酵条件

中图分类号S-3文献标识码A文章编号0517-6611（2019）02-0007-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.003

胰蛋白酶（Trypsin，EC 3.4.4.4）是蛋白水解酶类的一种[1]，具备由天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸氨基酸残基所组成的催化三联体的典型特征。胰蛋白酶具有的2个重要特征可以将其与其他丝氨酸蛋白酶区分开来：能专一性地把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前体，起活化作用[2]。另外，在碱性条件下胰蛋白酶具有较高的催化活力，所以是一种碱性蛋白酶。胰蛋白酶在医药[3-6]、食品[7]、皮革加工[8]、纺织和农业领域[9]有着广泛的应用价值。

通过链霉菌属菌株产的胰蛋白酶主要有红热链球菌Streptomyces eryrhreus产胰蛋白酶（SET），弗氏链霉菌Strepromyces fradiae产胰蛋白酶（SFT）和灰色链霉菌Streptomyces  griseus产胰蛋白酶（SGT）。目前，微生物产胰蛋白酶仍处于研究阶段，产酶效率不高，与商业化生产仍有差距。该研究探讨高产胰蛋白酶的诱变灰色链霉菌菌株的最优发酵培养基，同时探寻SGT的最佳发酵条件，为SGT的商业化生产提供依据。

1材料与方法

1.1菌株

灰色链霉菌为山东隆科特酶制剂有限公司省重点实验室诱变筛选保藏菌种（Streptomyces griseus），命名为LD 1810。

1.2培养基斜面培养基：PDA培养基;

基础发酵培养基：豆饼粉40 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸镁2 g/L，磷酸二氢钾2 g/L。

1.3培养基组成的确定

保持基础培养基其他组成不变，依次改变培养基的氮源、碳源和无机盐，测定发酵液中胰蛋白酶活力。确定最佳氮源、碳源和无机盐后，对氮源、碳源及无机盐进行正交设计试验，以找出菌体发酵最好的优化培养基，试验因素及水平见表1。

1.4产酶培养条件的确定

试验分别从培养温度、培养基初始 pH、摇瓶培养基装液量和摇床转速等方面进行单因素试验，确定最佳培养条件。

1.4.1培养温度对发酵产酶的影响。

分别设定发酵温度为24、26、28 、30和 32 ℃，在豆粕40.0%、磷酸二氢钾2.5%、氯化钙1.0%、葡萄糖20.0%的培养基，pH 8.0，装液量100 mL，240 r/min条件下发酵5 d后，取发酵液离心测定酶活力，考察不同温度条件下发酵产酶的变化规律。

1.4.2初始pH对发酵产酶影响的研究。

分别取初始pH为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在豆粕40.0%、磷酸二氢钾2.5%、氯化钙1.0%、葡萄糖20.0%的培养基，28 ℃，装液量100 mL，240 r/min条件下发酵5 d后，取发酵液离心测定酶活力，考察不同pH条件下发酵产酶的变化规律。

1.4.3装液量对发酵产酶影响的研究。

装液量分别选取50、75、100、125、150和200 mL，在豆粕40.0%、磷酸二氢钾2.5%、氯化钙1.0%、葡萄糖20.0%的培养基，28 ℃，pH 8.0，240 r/min条件下发酵5 d后，取发酵液离心测定酶活力，考察不同装液量条件下发酵产酶的变化规律。

1.4.4转速对发酵产酶的影响。

分别取转速为100、150、200、240、260和300 r/min，在豆粕40.0%、磷酸二氢钾2.5%、氯化钙1.0%、葡萄糖20.0%的培养基，28 ℃，pH 8.0，装液量100 mL条件下发酵5 d后，取发酵液离心测定酶活力，考察不同转速条件下发酵产酶的变化规律。

1.5酶活测定方法

胰蛋白酶参照中国药典方法[10]进行测定。

2结果与分析

2.1发酵时间的确定

灰色链霉菌在摇瓶中培养7 d，每24 h 取样测酶活。由图1可知，灰色链霉菌发酵前5 d，胰蛋白酶酶活性迅速上升，酶活力持续增加，发酵5 d时酶活力最高达到81.5 U/mL。发酵5 d后，随着发酵时间的延长，酶活有所下降，究其原因是发酵后期，营养物质消耗殆尽，微生物衰老死亡，产酶能力下降。综合发酵的变化情况，选取5 d作为发酵时间。

2.2灰色链霉菌产酶发酵培养基的确定

2.2.1碳源种类对灰色链霉菌产胰蛋白酶的影响。

基础培养基中分别添加浓度为2%的不同碳源作为唯一碳源，发酵产酶结果见图2，结果表明，葡萄糖作为碳源时灰色链霉菌所产酶活最大，为85.4 U/mL，麦芽糖次之，菌种对这2种碳源利用效果较好，说明菌体对麦芽糖和葡萄糖的利用最好。葡萄糖不仅能够提供合成代谢所需的能量，也能在细胞分解代谢中提供小分子碳架，同时葡萄糖较为廉价，因而选择葡萄糖作为碳源。

2.2.2氮源种类对灰色链霉菌产胰蛋白酶的影响。