新疆药桑总黄酮的富集纯化工艺研究

何倩 苏比努尔 李俊辉 等

摘要 [目的]通过对大孔树脂的筛选和单因素考察，对药桑总黄酮纯化富集工艺进行优化。[方法]选择静态吸附-解吸试验筛选纯化药桑总黄酮的大孔树脂型号，采用紫外法测定总黄酮含量。进一步根据上样液流速、上样液质量浓度、pH、洗脱剂用量及洗脱剂流速确定最优富集工艺;采用高效液相色谱法进行主要成分检测，从而对单体成分含量进行控制。[结果]AB-8型大孔树脂对药桑黄酮的吸附与洗脱性能较好，最优纯化条件为药液浓度0.208 mg/mL、pH 4、上样液流速1.5 mL/min，再用70%乙醇溶液40 mL进行洗脱。[结论]AB-8型大孔树脂可有效富集、纯化药桑总黄酮，通过HPLC进行质量监控可保证纯化工艺稳定可行。

关键词 药桑;总黄酮;大孔树脂;富集;纯化工艺

中图分类号 R284.2文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）04-0176-05

药桑在植物学分类上属桑科（Moraceac）桑属（Morus L.）黑桑种（Morus nigra Linn.）[1]，是植物药桑树的成熟果穗，集中分布在新疆阿克苏、和田、喀什等地区，也是新疆传统民间药材[2]，《本草纲目》中记载“桑果实常用可起活血补脑、通脉护肝、强生健体、强肾利尿、降压降脂、解酒护肝的作用，可治麻疹、水痘、咽炎、气管炎、口舌生疮、牙周炎等疾病”。现代医学研究表明，新疆药桑具有提高人体免疫力、降血压、降血脂、降血糖、美颜抗衰老等作用[3-5]，是珍贵的药食两用资源。

现今，随着国内外对药桑药用价值及药理活性的研究深入，发现药桑中含有多糖、黄酮、生物碱、氨基酸等活性成分[6-7]。傅大煦[1]对新疆桑椹的抗高血压活性筛选中发现其有效部位为花色苷等黄酮类成分，认为其作用主要与黄酮类化合物的抗氧化作用有关。因此黄酮类组分可能是药桑发挥药理作用的重要活性物质，但关于药桑黄酮类物质的分离纯化技术鲜见报道，这直接影响到后续药桑产品的开发成本及质量。笔者对药桑中总黄酮化合物的提取及纯化工艺进行研究，选用5种不同物理和化学性能的大孔树脂，以树脂的静态吸附量和解吸率为考察指标，确定适宜纯化药桑总黄酮的树脂类型;然后依次考察树脂吸附因素（吸附液pH、上样量及浓度、流速）对药桑总黄酮吸附量的影響，通过考察洗脱液体积及流速评价树脂对药桑黄酮的洗脱能力，采用高效液相色谱法对经过最佳吸附条件进行富集的药桑黄酮进行质量控制，最终确定最佳富集条件。

1 材料与方法

1.1 材料 新疆药桑（Morus nigra Linn.），采集成熟期药桑，由新疆医科大学中药教研室徐海燕副教授鉴定为桑科黑桑种。无水乙醇、乙酸乙酯、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，天津市致远化学试剂有限公司;甲醇，天津永晟精细化工有限公司;AB-8、D-101、LX-17、LX-30、LSA-12型大孔树脂，西安蓝晓科技有限公司;芦丁对照品、槲皮素对照品、白藜芦醇对照品、绿原酸对照品，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器 UV-2700紫外-可见分光光度计（日本岛津）;Waters e2695高效液相色谱仪（美国waters）;R1001-VN 旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）;KQ3200DE电热恒温水浴锅（昆山市超声仪器有限公司）;TDL-5A 离心机（上海江仪仪器有限公司）;恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 药桑总黄酮的提取及含量测定。称取干燥处理、过40目筛的药桑粉末约2.0 g置于圆底烧瓶，加入70%乙醇80 mL，在80 ℃水浴下回流提取2次，每次60 min，合并滤液浓缩至1/2体积。滤过置100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得到药桑总黄酮粗提液备用。

1.3.1.1 芦丁标准曲线绘制。精密称取烘干至恒重的芦丁对品5 mg，用60%乙醇溶解，定容到25 mL，配成0.2 mg/mL的芦丁对照溶液，准确量取0、1、2、3、4、5 mL的对照品储备溶液分别置于10 mL容量瓶中，各加入60%乙醇至5 mL，再依次加入浓度为5%的NaNO2 溶液 0.3 mL摇匀，放置6 min， 后加入浓度为10%的 Al（NO3）3溶液0.3 mL，放置6 min，然后加入4%的 NaOH溶液4 mL，放置15 min，60%乙醇定容至10 mL。在波长为505 nm下测吸光度（A）。以吸光度（A）为横坐标、芦丁质量浓度（mg/mL）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.1.2 药桑总黄酮含量测定。精密吸取总黄酮提取液2 mL 置于25 mL具塞试管中，加入3 mL乙醇摇匀，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，摇匀静置6 min，再加入0.3 mL 10%Al（NO3）3溶液摇匀静置6 min，加入4 mL 4% NaOH溶液后摇匀静置15 min，加入0.4 mL乙醇溶液使具塞试管中液体总体积为10 mL。在505 nm处测定吸光度值，然后按照标准曲线法计算药桑总黄酮的含量。总黄酮含量（mg/g）=（Y×V）/W、总黄酮提取率=（Y×V）/（W×103）×100%，其中，Y为根据标准曲线方程计算出的药桑总黄酮的质量浓度（mg/mL）;V为原浸提液体积（mL）;W为提取用的药桑粉末的质量（g）。

1.3.2 药桑总黄酮的纯化。

1.3.2.1 大孔吸附树脂预处理。将5种不同型号树脂（AB-8、D-101、LX-17、LX-30、LSA-12）在95%乙醇中浸泡24 h，隔段时间用玻璃棒搅拌，使得树脂和乙醇充分接触并赶走空气，湿法装柱用蒸馏水洗涤至中性;然后加入5%的HCl溶液浸泡12 h，用蒸馏水洗至中性;最后加入5% NaOH溶液浸泡12 h后，用蒸馏水洗至中性，备用。

1.3.2.2 静态吸附试验及相关指标的计算。准确量取15 mL已预处理好的5种不同型号的大孔吸附树脂置于锥形瓶中，各加入40 mL药桑粗提液，置于摇床上振荡24 h，过滤取过滤液测定其中总黄酮的质量浓度，计算吸附量、吸附率。再将已吸附的大孔树脂置于锥形瓶，再加入70%乙醇40 mL置于25 ℃恒温振荡器振荡2 h，过滤测定解吸液中总黄酮含量，计算解吸率。静态吸附量=（吸附前样品总黄酮含量-吸附后滤液总黄酮含量）/树脂体积、解吸率=解吸液总黄酮含量/（吸附前样品总黄酮含量-吸附后滤液总黄酮含量）×100%。

1.3.2.3 药桑总黄酮对AB-8树脂吸附及解吸的影响。根据静态吸附试验相关指标的计算，该试验确定了AB-8大孔树脂对药桑黄酮组分吸附效果最好，因此进一步采用动态法比较AB-8大孔树脂对药桑黄酮成分的最佳上样浓度、上样流速、上样液pH以及洗脱剂浓度、洗脱体积对目标成分的富集分离最佳条件。

（1）样品液质量浓度对AB-8树脂吸附效果的影响。用静态吸附试验中吸附能力最强的AB-8大孔吸附树脂，分别饱和吸附质量浓度为0.084、0.125、0.167、0.208、0.252 mg/mL体积为60 mL、pH为4的药桑黄酮提取液，根据其吸附量计算树脂对药桑黄酮的吸附率，确定上样液的最佳质量浓度。

（2）上样液流速对AB-8树脂吸附效果的影响。取pH为4、质量浓度为0.208 mg/mL药桑黄酮提取液60 mL，分别以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min的流速通过AB-8大孔吸附树脂，准确测定药桑黄酮质量浓度，根据吸附率选择最佳上样流速。

（3）上样液pH对AB-8树脂吸附效果的影响。取质量浓度0.208 mg/mL药桑黄酮提取液60 mL，以1.5 mL/min的流速通过AB-8大孔树脂，通过柱体时调节药桑溶液pH分别为1、2、3、4、5，根据吸附率选择最佳的上样液pH。

（4）洗脱剂浓度对AB-8树脂解吸药桑总黄酮效果的影响。取质量浓度0.208 mg/mL、pH调节为4的药桑黄酮提取液60 mL，以1.5 mL/min的流速通过AB-8大孔树脂，选择10%、30%、50%、70%、90% 5种不同体积分数的乙醇溶液两倍柱体积下洗脱，根据解吸率选择最佳洗脱剂浓度。

（5）洗脱剂用量对AB-8树脂解吸药桑总黄酮效果的影响。取质量浓度0.208 mg/mL、pH调节为4的药桑黄酮提取液60 mL，以1.5 mL/min的流速通过AB-8大孔树脂，选择20、40、60、80和100 mL的70%乙醇溶液进行过柱洗脱，根据解吸率选择最佳洗脱剂用量。

1.3.3 高效液相色谱法验证富集纯化工艺。

1.3.3.1 色谱条件。色谱柱：大连伊力特C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：甲醇（A）-0.1 %甲酸（B）;梯度洗脱程序：0～40 min，20%A～80%A;流速1.0 mL/min;柱温35 ℃;进样量10 μL;检测波长335 nm。

1.3.3.2 对照品的制备。精密称取对照品芦丁9.87 mg、槲皮素11.80 mg、绿原酸10.01 mg、白藜芦醇9.96 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度作为对照品储备液;精密吸取一定比例的对照品储备液，混合均匀后制得芦丁20 μg/mL、槲皮素0.06 μg/mL、绿原酸15.50 μg/mL、白藜芦醇1.18 μg/mL的混标溶液，在水浴锅上蒸干备用。

1.3.3.3 供试品的制备。在“1.3.3.2”试验基础上，精密称取药桑提取液烘干后的粉末10.11 mg，置于10 mL容量瓶中，在超声条件下用甲醇溶解定容，在水浴锅上蒸干备用。

1.3.3.4 方法学考察。

（1）专属性。按“1.3.2.1”色谱条件进样，得到对照品溶液和药桑提取供试品样液HPLC色谱图，根据图谱各峰保留时间等考察试验专属性。

（2）线性关系。吸取对照品储备液1.0、1.5、2.0、5.0、10.0 mL 至10 mL容量瓶中，甲醇稀释定容制备成一系列对照品溶液。按“1.3.2.1”色谱条件进行测定，并记录峰面积，以峰面积对对照品浓度进行线性回归，计算回归方程。

（3）精密度。精密吸取綠原酸、芦丁、白藜芦醇、槲皮素浓度分别为4.5、10.0、0.3、0.046 μg/mL的混合对照品溶液1 mL，按“1.3.2.1”色谱条件重复进样5次，记录峰面积，计算RSD值考察仪器精密度。

（4）重复性。精密称取药桑过注后烘干粉末50 mg，用甲醇稀释定容至10 mL容量瓶，按“1.3.2.1”色谱条件进样，重复以上操作5次，记录峰面积并计算含量，计算RSD值考察方法的重复性。

（5）稳定性。取同一供试品溶液，分别在0、1、4、8、24 h时按“1.3.2.1”的色谱条件测定，记录峰面积，计算RSD值考察样品稳定性。

（6）加样回收试验。精密称取已知药桑粉末50 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容并在100 W超声条件下超声10 min，吸取已知浓度的混标溶液并加入。按照“1.3.2.1”色谱条件进样，计算各对照品加样回收率及RSD值。

1.3.3.5 样品测定。分别精密称取过柱前、后药桑粉末约50 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容并在100 W超声条件下超声10 min。按照“1.3.2.1”色谱条件进样，计算各成分纯度。

2 结果与分析

2.1 药桑总黄酮含量的测定 以芦丁为标准品，按“1.3.1.2”操作得到其吸光度，最终得回归方程Y=11.831 4x-6.19×10-4（R2=0.999 7），表明芦丁在0～1 mg/mL 呈良好线性关系。

在505 nm处测定吸光度，然后按照标准曲线法计算药桑总黄酮的含量为20.46 mg/g，RSD=1.08%（n=3），提取率为10.18%，RSD=1.58%（n=3）。

2.2 药桑总黄酮的富集纯化

2.2.1 树脂的筛选。5种大孔吸附树脂对药桑总黄酮的吸附、解吸性能见表1。由表1可知，AB-8和D-101的静态吸附量和吸附率均高于其他型号树脂，而AB-8的解析量和解吸率较其他型号树脂高，综合考虑吸附和解吸能力，确定此次试验选用AB-8 型大孔树脂纯化药桑总黄酮。

2.2.2 药桑总黄酮对AB-8树脂吸附及解吸的影响。

2.2.2.1 样品液质量浓度对AB-8树脂吸附效果的影响。从图1可以看出，当上样液浓度在0.084～0.208 mg/mL时，树脂的吸附率随着上样液浓度增加而提高，随着浓度进一步增大，吸附率反而呈降低的趋势。其原因可能为高浓度的上样液会使得黄酮组分超载导致通过柱床的速度减慢，不能被及时吸附，因此选择上样液的质量浓度0.208 mg/mL。

2.2.2.2 上样液流速对AB-8树脂吸附效果的影响。从图2可以看出，上样液的流速对药桑总黄酮吸附率的影响较大。当流速为1.5 mL/min时，其吸附率达到最大，随着继续增大，吸附率呈下降趋势。因此最佳的上样流速为1.5 mL/min。

2.2.2.3 上样液pH对AB-8树脂吸附效果的影响。从图3可以看出，当pH为4时，其吸附率达到最大，随着pH的继续增大，吸附率呈下降趋势。因此最佳的上样液pH为4。

2.2.2.4 洗脱剂浓度对AB-8树脂解吸药桑总黄酮效果的影响。从图4可以看出，供试液经过AB-8大孔树脂纯化后，30%、50%和70%乙醇洗脱部分解吸率较高。洗脱液浓度低于30%时，一些极性大的杂质类化合物被洗脱，造成固形物的得率高，但总黄酮的纯度低，最终选用70%乙醇溶液洗脱。

2.2.2.5 洗脱剂用量对AB-8树脂解吸药桑总黄酮效果的影响。从图5可以看出，洗脱剂用量对药桑总黄酮解吸率的影响较小。洗脱剂用量在40 mL以下时，随着洗脱剂用量的增大，对AB-8树脂的解吸率明显增大;洗脱剂用量在40 mL以上时，解吸率增大缓慢。可见，40 mL洗脱液较稳定。

2.3 高效液相色谱法验证富集纯化工艺

2.3.1 专属性考察。从图6可以看出，绿原酸、芦丁、槲皮素分离度良好。

2.3.2 方法学考察。由表3可见，绿原酸、芦丁、槲皮素3种对照品在质量浓度为0.059～20.000 μg/mL线性关系良好。精密度试验中，3种对照品的精密度RSD分别为1.92%、3.34%、1.47%。24 h 稳定性试验中，绿原酸、芦丁、槲皮素的RSD分别为0.890%、0.826%、2.520%，表明供试品溶液在24 h内稳定。重复性试验中RSD分别为1.18%、0.75%、2.10%，表明方法重复性良好。高、中、低不同浓度的平均回收率为89%～103%，RSD均小于2%符合相关要求。

2.3.3 样品含量测定。按照“1.3.3.5”操作，结果发现，通过HPLC法确定纯化后的药桑提取物中含有绿原酸、芦丁、槲皮素3种成分（图7），其含量分别为1.36、2.54、0.01 μg/mg。

3 讨论

新疆药桑为特色药材，在南疆地区广有种植，但由于其成熟期较短往往造成大面积的资源浪费，目前市场上也鲜有相关产品。为了更好地开发利用这一特色药食两用资源，在前期的基础性研究中通过网络药理学技术筛选出药桑抗糖尿病的多靶标及活性成分，初步发现，药桑中的槲皮素、白藜芦醇、桑色素等可能是药桑发挥抗糖尿病作用的主要成分，这些都属于黄酮类成分[8]。有报道认为，药桑黄酮不仅具有良好的抗氧化活性，而且对糖尿病大鼠具有较好的降血糖、降血脂作用[9]。进一步的作用靶点研究发现，活性成分的高频作用靶点可能与氮代谢、半乳糖代谢、PI3K-Akt信号通路等密切相关，这些作用通路可能是药桑发挥多组分协同防治糖尿病的活性依据。为了更加深入地研究药桑黄酮抗糖尿病的作用机制，有必要对其黄酮类药效物质进行进一步的分离纯化。

大孔树脂是目前工业上富集、纯化黄酮和皂苷类最为常用的高分子化合物[10-12]。该试验选择5种不同型号与类型的大孔树脂，通过静态吸附-解吸试验，利用紫外的NaNO2法对药桑中黄酮含量进行测定，比较确定AB-8型大孔树脂作为纯化药桑总黄酮的最优树脂。进一步通过因素考察确定了最佳纯化工艺：药液浓度约为0.208 mg/mL、pH为4、上样液流速1.5 mL/min，再用70%乙醇溶液40 mL进行洗脱，非常适用于药桑总黄酮的工业化制备。

该试验考虑仅仅以紫外法作为总黄酮含量的测定方法不够准确，因为药桑总黄酮中的主要成分除了芦丁外，还含有绿原酸、槲皮素、白藜芦醇、桑色素等[13-14]，传统的紫外方法只以芦丁为标准进行测定，方法并不能直接体现出活性成分的含量变化，HPLC法可以对黄酮类中的具体物质进行准确地定量测定，因此试验进一步利用HPLC法确定药桑中含有绿原酸、芦丁、槲皮素，并定量得到纯化后药桑提取物中绿原酸、芦丁、槲皮素的含量分别为1.36、2.54、0.01 μg/mg。方法学验证证明可以用此方法对黄酮类物质进行质量监控，从而得到纯度和含量均较高的黄酮物质。

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