天津地区几种黄瓜真菌、细菌及病毒性病害研究

周莹 常雪艳 杜爽 刘何 葛琳

摘    要：针对目前黄瓜各种真菌性病害、细菌性病害和病毒性病害高发的现状，对天津地区黄瓜病害的发生情况进行田间观察，并运用试纸条法、PCR法及RT-PCR法对黄瓜种子和叶片样品进行检测。结果表明：田间观察发现，天津地区黄瓜病害主要有细菌性病害、真菌性病害及病毒性病害，其中真菌性病害最为普遍，褐斑病、白粉病、霜霉病多发;试纸条法在30份黄瓜品种种子样品中检出种传病害瓜类细菌性果斑病病原（Aac）1份，在11份叶片样品中检测出黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）和烟草花叶病毒（TMV）各1份;PCR法在30份种子样品和2份疑似病害叶片样品中有3份种子样品检出细菌性角斑病;RT-PCR法在30份种子样品和6份疑似病害叶片样品中有1份叶片同时检出黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）和烟草花叶病毒（TMV）。

关键词：天津;黄瓜;病害

中图分类号：S436.421          文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.06.008

Abstract： In view of the current situation of various fungal diseases， bacterial diseases and viral diseases of cucumber， the experiment was conducted to investigate the occurrence of cucumber diseases in Tianjin through field observation， the seed and leaf samples of different cucumber varieties were detected by the method of dipstick methodology， PCR and RT-PCR. The results showed that according to the field observation， there were mainly bacterial diseases， fungal diseases and viral diseases occurred in cucumber in Tianjin， among which the fungal disease was the most common， especially brown spot disease， powdery mildew， downy mildew occurred frequently. Basing on the dipstick methodology， Acidovorax citrulli （Aac） was detected in 1 seed sample of 30 cucumber varieties， the Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） and Tobacco mosaic virus （TMV） were detected in 1 leaf sample of 11 cucumber leaf samples. Basing on the PCR results， the bacterial keratoderma was detected in 3 seed samples of 30 cucumber varieties but not detected in 2 leaf samples. The results of RT-PCR were showed that the Cucumber green mottled mosaic virus （CGMMV） and Tobacco mosaic virus （TMV） were detected in 1 leaf sample of 6 leaf samples but not detected in 30 seed samples.

Key words： Tianjin; cucumber; diseases

目前，隨着农业种植结构的调整，蔬菜产业已成为农业的重要支柱产业，是带动农民增收的主要产业之一。在我国，蔬菜是除粮食作物外栽培面积最广、经 济地位最重要的作物，2016年我国蔬菜产量在80 005万t，种植面积在2 166.9万hm2左右，居农产品之首[1]。黄瓜是一种具有高经济价值适于广泛栽培的作物，以其果蔬两用型的特点，成为设施栽培中最常见的品种之一，是我国保护地栽培的作物中第一大蔬菜作物[2]。黄瓜肉质脆嫩、汁多味甘，深受人们的喜爱，在我国蔬菜的周年供应中起着重要的作用。

天津地区黄瓜种植面积约为10 666.67 hm2，产量72万t（2016年），在生产时多采用温室栽培的方式，但由于特定的温室环境、累年连作以及农药的不科学使用，各种真菌性病害、细菌性病害和病毒性病害发生普遍，造成巨大经济损失。天津地区黄瓜病害发生程度日趋严重，例如2016年和2017年，黄瓜褐斑病的棚发率在90%，而病毒病流行年份部分地区发病率可达100%[3]。

目前，黄瓜病害常见病害有十余种（表1）[4]，笔者利用病害检测试纸条、PCR及RT-PCR等方法对38个黄瓜样品进行了病害检测，旨在了解天津地区黄瓜病害情况，为天津黄瓜农业生产中病害防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器设备

试验品种（表2），均来自天津科润农业科技股份有限公司，试验仪器设备、试剂和耗材信息详见表3。

1.2 方 法

试验于2018年天津市蓟州区玉米场和良种场两地进行试验调查。

育苗分大棚早春茬、秋延茬2个茬口。育苗采用穴盘育苗，穴盘规格为72孔;育苗基质为（草炭∶珍珠岩=10∶1）。种子在55 ℃的温水中浸泡1 h，然后放在30 ℃恒温箱中催芽，待到胚根露出种皮后播种，播种深度约1 cm。播种后覆盖地膜，幼苗露出基质表面后及时揭除地膜，后按常规管理，苗期不进行肥料补给。每小区20株，株距为30 cm，行距30 cm，畦间隔90 cm，小区面积为3.6 m2。整个种植过程中水肥采用常规管理[5]。

1.2.1 田间观察    通过观察田间种植的黄瓜结合各病害的特点对黄瓜病害进行判别。

1.2.2 试纸条法    使用Agdia试纸条对30份黄瓜种子、11份疑似病害叶片进行检测。黄瓜种子的检测目标病原有：黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）、瓜类细菌性果斑病病原（Aac）;疑似病害叶片检测病原有：烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）、小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、瓜类细菌性果斑病病原（Aac）、疫霉属鞭毛菌（PHYT）。具体方法参照试剂条使用说明。

1.2.3 PCR法    目标病原：细菌性角斑病病菌。细菌性角斑病病菌为种传病害，对30个黄瓜种子样品和2份疑似病害叶片进行检测。使用植物组织DNA提取试剂盒提取DNA，并对DNA纯度和浓度进行测定。引物序列为F：GTTCGGCGACGCAATCAATG，R：GTTGACTTCTTCGGCGGTGG;扩增片段大小为179 bp，引物合成工作由华大基因公司完成。按表4配制PCR反应体系进行PCR扩增，PCR扩增程序为：95 ℃预热3 min;95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃ 5 s，35个循环;72 ℃延伸5 min[6]。PCR扩增完成后进行电泳检测，对凝胶成像进行拍照分析。

1.2.4 RT-PCR法    目标病原：黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒（TMV）。CGMMV为种传病毒，对30份黄瓜种子样品及6份疑似病毒病叶片进行检测。同时对6份疑似花叶病害叶片进行CMV及TMV检测。

使用TRIZOL提取總RNA，并测定RNA纯度和浓度。引物序列见表5，根据表中序列进行引物的合成，合成工作由华大基因公司完成。按如下操作进行cDNA的合成：（1）PCR管中加入1 μL总RNA，1 μL引物，65 ℃温浴7 min，冰浴5 min，瞬离;（2）再向PCR管中加入1 μL的RT ，4 μL的5×缓冲液，总反应体系为20 μL，其他用ddH2O补齐;（3）反应参数：37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃冷却[7]。产物于-20 ℃冷冻保存。合成cDNA后，PCR过程参照1.2.3。PCR扩增完成后进行电泳检测，对凝胶成像进行拍照分析。

2 结果与分析

2.1 田间观察

通过田间观察及病害判别，天津地区试验用的30个黄瓜品种在生长过程中多发褐斑病、白粉病、霜霉病、灰霉病（图1）。

2.2 试纸条法

利用Agdia试纸条（图2）对30份黄瓜种子样品进行了种传病毒病害黄瓜绿斑驳花叶病毒和瓜类细菌性果斑病病原的检测，细菌性果斑病检出1份，黄瓜绿斑驳花叶病毒未检出;对温室种植黄瓜出现病害的11份叶片样品进行了烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）、小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、瓜类细菌性果斑病病原（Aac）、疫霉属鞭毛菌（PHYT）的检测，检出CGMMV和TMV各1份，其他均未检出。

2.3 PCR法

通过PCR法对30份黄瓜种子样品及2份田间疑似病害叶片进行检测，如图3中结果显示：30份种子样品及2份病害叶片中S3（津优409）、S4（津优601）、S7（津春4号）种子的检测样品中细菌性角斑病病菌检测呈阳性。

2.3 RT-PCR法

通过RT-PCR法对30份黄瓜种子样品及6份田间疑似花叶病害叶片进行检测，如图4、图5中黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）凝胶电泳的检测结果显示：30份黄瓜种子样品中黄瓜绿斑驳花叶病毒未检出;6份疑似黄瓜绿斑驳花叶病毒病叶片中有1份（叶3）检测结果呈阳性。

通过RT-PCR法对6份田间疑似花叶病害叶片进行检测，如图6中黄瓜花叶病毒（CMV）凝胶电泳的检测结果显示：6份疑似花叶病毒的叶片中，CMV未检出，与试纸条法检验结果相同。

通过RT-PCR法对6份田间疑似花叶病害叶片进行检测，如图7中烟草花叶病毒（TMV）凝胶电泳的检测结果显示：6份疑似花叶病毒的叶片中，有1份叶子样品（叶3）TMV呈阳性，与试纸条法检验结果相同。

3 结论与讨论

目前，在我国黄瓜栽培中常见的病害主要为真菌病害，如白粉病、霜霉病、褐斑病[8-10]。近年来，褐斑病发病严重，个别地区棚发率100%[3]。笔者对天津地区黄瓜常见的病害进行调查，亦以这三种病害为主，但白粉病和霜霉病比褐斑病多发。对细菌性角斑病和细菌性果斑病进行了检测，均有检出，其中细菌性角斑病检出3份种子样品呈阳性，细菌性果斑病检出1份种子样品呈阳性，种子带菌检出率为13.3%。病毒病具有高致病性、传播速度快、难以防治[11]，一旦蔓延，将会对黄瓜生产造成毁灭性的损失，在检测中黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）、烟草花叶病毒（TMV）均有检出。有研究表明，天津地区黄瓜主要毒原种类有黄瓜花叶病毒（CMV）、西瓜花叶病毒（WMV）、烟草花叶病毒（TMV）3种病毒，且存在病毒复合侵染[12]，本试验中，黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）和烟草花叶病毒（TMV）同时在叶片3样品被检出，说明天津地区黄瓜病毒病害同样存在复合侵染的情况。由于本试验区域有限，采集样本数不够大，覆盖品种也不够丰富，所以无法完全检出本地区黄瓜病害的所有病原，还需进一步开展检测研究。

参考文献：

[1]作者不详.2017年中国蔬菜种植面积及产量统计分析 [EB/OL].（2017-07-19）[2018-12-12].https：//www.sohu.com/a/158295069_775892.

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[11]李焕玲.蔬菜四种细菌性新病害病原菌的鉴定研究[D].北京：中国农业科学院，2013.

[12]李淑菊，王慧哲，霍振荣，等.利用RT-PCR对黄瓜病毒病毒原种类进行检测[J].华北农学报，2003，19（3）：100-102.