肺癌患者血浆检测肿瘤标志物的分析方法及展望

魏优蕾 郭晓彤

摘要：非小细胞肺癌（NSCLC）患者进行靶向治疗前需要鉴定多种生物标志物，包括EGFR、ALK、ROS-1和PD-L1，通常经手术、穿刺等途径获取样本。液体检测是目前新兴的肿瘤标记物检测方法，它可以从血浆中提取出循环系统中的肿瘤DNA（ctDNA），具有低风险、取样简单、术后不适感少等优点。常用的液体活检方法有定量聚合酶链反应（PCR）、数字PCR技术、新一代测序技术（NGS）。本文简要地阐述了上述分析方法的研究进展及未来应用方向。

关键词：肺癌;肿瘤标志物;液体检测

中图分类号：R734.2                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.07.014

文章编号：1006-1959（2019）07-0039-05

Abstract：Non-small cell lung cancer （NSCLC） patients need to identify a variety of biomarkers， including EGFR， ALK， ROS-1 and PD-L1， before they are targeted. Usually， the samples are obtained by surgery， puncture and other means. Liquid detection is an emerging method for detecting tumor markers. It can extract tumor DNA （ctDNA） from the circulatory system from plasma， and has the advantages of low risk， simple sampling， and less postoperative discomfort. Commonly used liquid biopsy methods are quantitative polymerase chain reaction （PCR）， digital PCR technology， and next-generation sequencing technology （NGS）. This paper briefly describes the research progress and future application directions of the above analytical methods.

Key words：Lung cancer;Tumor markers;Liquid detection

目前个体化医疗模式已经彻底改变了肺癌的诊断和治疗方式。明确肿瘤病理类型，采取相应最佳治疗方案是肺癌治疗的基本准则。生物标志物的检测对于免疫、靶向等治疗至关重要，其中包括目前比较热门的EGFR、ALK和ROS -1等。虽然肺癌的诊断和治疗方面已经取得了重大进展，但肺癌的延迟诊断问题日益凸显[1]。晚期（ⅢB-Ⅳ）非小细胞肺癌（NSCLC）患者在肺癌分期总人群中占有更高比例。细胞学标本或组织是唯一可用于形态学诊断和分子评估的材料[2，3]。据统计，高达30%的晚期NSCLC患者难以获取有效活组织标本[4]。在此条件下进行标志物检测极具挑战性而非侵入性“液体活检”技术可以避免上述问题，并且具有应用范围广、快速高效、低操作风险等优势[5]。血浆来源的循环肿瘤DNA（ctDNA）是目前许多研究用于非小细胞肺癌患者的主要样本来源[6-11]，通过液体活检技术对血浆ctDNA进行EGFR检测;应用血浆ctDNA检测外显子20 EGFR点突变（p.T790M）的耐药情况。上述实验表明液体活检技术可以用于指导酪氨酸激酶抑制剂（TKI）用药。主要缺点是血液样本中ctDNA含量较低，仅占总细胞游离DNA的<0.5%[12]。因此需要提高灵敏度技术避免假阴性风险、详细的临床验证减少假阳性情况的发生。本综述的目的是提供目前用于肺癌患者ctDNA分析临床实践方法的最新信息。

1 ctDNA的检测方法

1.1 ctDNA的收集和提取  液体活检获得数据质量的高低取决于以下3个关键步骤：抽血、ctDNA离心和ctDNA提取。

抽血和血浆分离的间隔时间至关重要[13]，在同一实验室内分析样本有助于缩短抽血、ctDNA离心和ctDNA提取之间的周转时间。采集管建议使用含EDTA的试管（Vacutainer，BD，Plymouth，UK）以避免凝血，采血量最多10 ml。在外部机构中收集样本时，建议使用具有不含甲醛的防腐剂、减少非肿瘤循环细胞释放基因组DNA、抑制ctDNA降解、在室温下储存样品等优点的PAXgene Blood DNA管（Qiagen，Hilden，Germany）或Cell-Free DNA BCT管（Streck，La Vista，NE，USA）[14，15]。Toro PV等的研究所证明[14]，BCT管可以防止细胞在抽血后7 d内溶解，效果较PAXgene管好。

采血后关键点在于收集后1 h内离心血浆。ctDNA具有15 min的半衰期，快速离心能确保获取的血浆和/或血清中具有足够量的ctDNA，避免假阴性的风险。通常可进行2次离心（2300 rpm，10 min）获得1.2 ml血浆。也有关于3次离心的报道，如Page K等[16]进行3次离心（条件依次为：1000 g，4℃ 10 min;1000 g或2000 g或10000 g，4℃，10 min;1000 g，室溫，5 min。有研究对11种提取ctDNA的方法进行评估[17，18]，其推荐3种具有高准确度和重复性的试剂盒：QIAamp循环核酸试剂盒（Qiagen）、Norgen血浆/血清循环DNA纯化迷你试剂盒、Norgen lasma / Serum无细胞循环DNA纯化迷你试剂盒（Norgen，Thorold，ON，Canada）。

1.2定量聚合酶链反应  实时聚合酶链反应（PCR）技术是检测ctDNA常见方式。在此基础上加以改进，可提高ctDNA检测的敏感性和特异性[19]。

改良PCR技术的扩增阻碍突变系统（ARMS）。ARMS核心在于突变特异性探针，该探针由连接到3'和5'末端的荧光团和猝灭剂组合而成。存在突变的时，探针与靶位点结合发生聚合酶反应，促使荧光团和猝灭剂分离，荧光含量增加后对其检测和测量;反之，荧光标记物难以测出[20]。在此基础上可通过添加等位基因特异性Scorpion引物（ARMS/S）进一步改进PCR技术。这些Scorpion引物具有茎環部分，茎环上有荧光团和猝灭剂。环序列与PCR产物互补，促使茎环的解折叠，在PCR扩增的退火/延伸阶段期间产生荧光[21]。例如：肽核酸（PNA）能够选择性聚集突变PCR产物，抑制野生型等位基因的扩增[22]。

ARMS/S技术用于ctDNA中EGFR突变检测的具有较高的特异性和较低的灵敏性。Kimura H等[23]将此项技术应用于42例NSCLC患者的配对的肿瘤血清样品中，仅发现3例不一致病例，证实ARMS/S技术的具有高度特异性;IPASS研究表明ARMS/S具有高特异性（100%，ctDNA无假阳性结果）而EGFR突变灵敏度较低（43.1%），可能由使用血清样本替换血浆样本造成的差异[24];Douillard JY等[25]分析了从NSCLC患者血浆样本中提取的ctDNA，灵敏度为65.7%。因此以血浆代替血清为介质可以减少假阴性结果，提高检测的灵敏度。

此外，PNA改良的ARMS/S技术可显著提高ctDNA检测的灵敏性及特异性。Karachaliou N等[6]提出PNA介导的5'核酸酶实时PCR（TaqMan）具有78%的灵敏度和100%的特异性;Pasquale R等人采用的PNA钳技术[26]，结果证实特异性为100%，灵敏度为65.4%;Thress KS等[27]实验报告了EGFR突变的高敏感性（82%～87%）和特异性（97%），同时也获得了耐药点突变p.T790M的较低灵敏度（73%）和特异性（67%）。上述实验结果印证ARMS/S技术能够有效提高PCR检验报告的质量。

1.3数字PCR技术  数字PCR（dPCR）是一种能够在单分子水平上进行鉴定和定量各种突变基因的新技术。该技术通过荧光探针对目标序列进行拷贝并实现量化[28]。到目前为止已经研发了多种型号，包括数字液滴PCR（ddPCR）、数字固体PCR（dPCR）和微珠、乳液、扩增和磁性（BEAMing）[29]。

dPCR在血浆检测ctDNA相关标记物特异性和敏感性的相关研究。Yung TK等[30]使用dPCR方法从EGFR外显子19缺如以及外显子21 p.L858R的血浆样品中提取的ctDNA并进行检测。通过与组织样本比较，血浆样本能够实现92%的敏感性和100%的特异性。结果表明dPCR检测血浆ctDNA具有一定的敏感性和特异性。

然而，Sacher AG等[31]从两组患者的血浆样本中提取ctDNA并行ddPCR检测。其中一组为基线测试的患者，另一组为疾病进展评估的患者。从基线组群中的组织进行活检，活检分两种情况：初始组织活检和疾病进展的组织再次活检。最终获得的结果与从ctDNA样品获得的结果进行比较。对EGFR敏感和KRAS突变的特异性和阳性预测值高达100%，而敏感性为64%至86%。对于EGFR p.T790M突变的敏感性、特异性和阳性预测值分别为77%、63%、79%;Thress KS等采用BEAMing法[27]证实在变异试验中，EGFR外显子19缺如的cobas EGFR与外显子21 p.L858R的cobas  EGFR有相同的灵敏度和特异性。与cobas  EGFR变异试验相比，BEAMing对p.T790M突变的ctDNA检测有更高的灵敏性（81%）和更低的特异性（58%）。因此dPCR在血浆检测灵敏性和特异性与检测相关标记物不同而有所差异。

Oxnard GR等[32]应用BEAMing法提取ctDNA样本，对血浆基因分型和肿瘤中心组织分析结果比较，表明p.T790M的ctDNA检测灵敏度为70%，特异性为69%。猜测组织肿瘤样本中p.T790M突变的变异组织分布差异导致了检测的低特异性[32，33]。随后他们通过正交分析验证上述猜想：在18个不一致病例中78%的患者存在p.T790M突变（血浆阳性/组织阴性）。结果证实血浆ctDNA分析法具有低灵敏度和假阴性的可能性。因此，建议dPCR对血浆标本pt790M阴性的患者进行多次检测以降低假阴性的发生率。

1.4下一代测序技术  近年研究已经将下一代测序技术（NGS）应用于液体活检领域。NGS 是一种高通量方法，能够在一次运行中同时对不同患者的不同基因靶点进行快速测序[34，35]。NGS的基本工作流程按照DNA库的生成、单个片段的克隆扩增、大规模平行测序和数据统计分析的顺序进行[36，37]。用NGS对血浆ctDNA检测相关研究层出不穷，随着研究深入，NGS技术在液体活检领域逐步改良并趋于成熟。

用个体化基因组测序仪（PGM）从血浆样品中提取的测序的ctDNA，并以肿瘤组织样本中鉴定的DNA突变作为参考，得出结论：NGS的敏感性为58%，特异性为87%[38]。表明NGS在ctDNNA检测中具有较低的灵敏度和较高的特异性。NReckamp KL等[39]用短足突变增加NGS聚集进而改良NGS技术并取得更佳的检测灵敏性和特异性（p.T790M、p.L858R和外显子19缺如的灵敏度分别为93%、100%和87%）。由此改善了液体活检分析的性能。

此外，NGS技术还有其特有优势。Paweletz CP等[40]进行了定向NGS测定实验，结果显示定向NGS不仅能够使目标读数最大化，还能使血浆来源的ctDNA中的伪影最小化;通过使用ddPCR和靶向NGS这两种方法，对29例EGFR和KRAS已知突变状态的患者的ctDNA血浆样本（组织分析）进行分析，结果显示EGFR和KRAS的敏感性分别为86%和79%。值得注意的是，NGS测定法对两种类型突变的特异性均高达100%;最后对48例病例含有62种目前已知的突变因子患者分析，结果显示此方法的驱动突变敏感性为77%、耐药突变的敏感性为100%。研究结果证实NGS检测血浆ctDNA的灵敏度虽然欠佳，但在精确性、特异性较为可靠，尤其是在EGFR和KRAS相关突变的敏感性等方面具有良好的表现。Newman AM等[41]通过深度测序（CAPP-Seq）法分析在NSCLC的不同阶段收集的血浆中的ctDNA结果表明Ⅰ期肿瘤的诊断敏感性为50%，Ⅱ-Ⅳ期肿瘤为100%，所有阶段的总体敏感性为85%、特异性为96%。NGS技术可应用于不同阶段肺癌患者，结果比较可靠准确。

上述研究證实了使用靶向NGS检测肺癌中的ctDNA的可行性，尤其是在初始分子评估和监测等方面表现出良好的敏感性和特异性，并且具有多样本平行检测、检测速度快和适用范围广等特点。

2对ctDNA中的EGFR突变结果的分析

警惕ctDNA测定的低敏感性（组织阳性患者出现的假阴性结果）和特异性（组织阴性患者出现的假阳性结果）情况。在复发的肿瘤组织中，p.T790M突变的异质性分布限制了ctDNA检测的准确性[42，43]。肿瘤异质性分布影响检测结果质量;在AURA实验中，血浆来源的ctDNA中检测为p.T790M阴性，而组织样本中p.T790M阳性，但阳性结果组具有更高的客观反应率和更长的中位无进展生存期[32，33]。血浆假阴性结果干扰ctDNA检测的可靠性。

尽管存在上述问题，血浆检测法在EGFR活化或耐药性突变等方面的检测还是非常可靠的。通过正交技术进行重复检测可轻易地避免假阴性结果的问题[42]。因此，在进行液体活检后，p.T790M ctDNA阳性的患者可以进行第三代TKI（例如osimertinib）治疗，而阴性结果的患者则应进行重复检测，以排除假阴性结果的可能性。

3总结及展望

诊断延迟是当今干扰肺癌治疗重要问题之一，直接影响肺癌的早期治疗措施的实施，进而造成较差的预后;组织活检法和细胞学活检法在诊断晚期NSCLC方面具有极高的挑战性。主要原因在于组织活检不能取到有效的能够反映疾病类型的组织样本，细胞学活检则通常情况下很难取到有意义的组织细胞。而ctDNA液体活检法可以有效地解决上述问题。采用高灵敏度检测技术能够有效限制液体活检法的假阴性和假阳性结果的产生。定量PCR（qPCR）是目前比较推崇的方法，并且近期的几项临床试验同样证明了液体活检在评估NSCLC患者EGFR突变中发挥了重要作用。尽管如此，由于血液中突变等位基因的含量低，该方法可能会因低敏感性而影响其结果可靠性。但是在未来，我们希望NGS这样的尖端技术能够消除这种限制，能够在更多的患者中同时识别更多类型的基因突变（ALK、ROS-1、RET易位、BRAF突变、MET 外显子14缺如）、融合和易位。使肿瘤学家够以此鉴定肿瘤学标志物，并为NSCLC患者定制个体化治疗方案。

虽然本次综述重点叙述了肺癌患者ctDNA的主要方法，并将无创检测法应用并扩展到NSCLC患者的诊断、治疗及管理的不同环境中（如治疗效果、并发症、复发情况的跟踪监测等）。但不能排除体液中其他诊疗相关的生物学靶点在肺癌治疗中的作用，如循环中的肿瘤细胞、血小板相关核酸以及与肿瘤相关的其他成分（如尿液、痰液和体液）。

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收稿日期：2019-1-4;修回日期：2019-1-13

編辑/肖婷婷